胡亮
- 作品数：9 被引量：0H指数：0
- 供职机构：上海交通大学医学院基础医学院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 基因治疗中若干关键问题的基础研究
- 钱关祥戴冰冰卢健李锋应磊张萍梅文瀚徐荣婷胡亮王克敏
- 该项目是针对基因治疗中存在的一些关键问题的基础研究工作，从目的基因的克隆，基因表达的靶向性以及基因表达水平的提高多个方面进行了研究。主要用于基因治疗中进一步的基础以及临床研究工作。主要是：用于提高肿瘤基因治疗中的目的基因...
- 关键词：
- 关键词：基因治疗靶向表达
- 人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达
- 2006年
- 目的构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体,观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-RGN,将pEGFP-RGN转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-zeocin中,构建真核表达pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo的重组体,将pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,用脂质体转染入HK-2细胞,荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGN cDNA全长是897 bp,以此构建的pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体,经DNA测序与GenBank中的人RGN cDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo真核表达质粒,并在HK-2细胞中表达。
- 徐洪胡亮倪培华吴洁敏赵涵芳
- 关键词：REGUCALCIN真核表达载体转染
- 葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡信号传导途径的研究
- 2007年
- 目的:探讨葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)凋亡的信号传导途径。方法:利用葡萄糖诱导细胞凋亡:将不同浓度葡萄糖作用于HK-2细胞不同时间,并经透射电镜观察、流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞。采用抑制剂拮抗葡萄糖诱导凋亡:分别将不同浓度的蛋白激酶C抑制剂(hypericin)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)抑制剂(apopain)、蛋白酪氨酸激酶抑制剂(genistein)、一氧化氮合酶抑制剂(NAME)作用于HK-2细胞30min,再加50mmol/L葡萄糖作用48h,后行FCM检测HK-2细胞凋亡情况。结果:50mmol/L葡萄糖作用48h可诱导HK-2细胞发生凋亡,并可通过透射电镜观察到凋亡小体,而FCM检测发现10-4mmol/Lhypericin、10-4mmol/L和10-6mmol/Lapopain、10-7mmol/Lgenistein、10-2mmol/LNAME可明显抑制葡萄糖诱导的HK-2细胞凋亡。结论:蛋白激酶C、caspase-3、蛋白酪氨酸激酶、一氧化氮(NO)都参与了葡萄糖诱导HK-2细胞凋亡的信号传导过程。
- 胡亮倪培华徐洪赵涵芳吴洁敏钱关祥
- 关键词：细胞凋亡信号传导
- 人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达
- 2006年
- 目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。
- 徐洪胡亮倪培华吴洁敏赵涵芳
- 关键词：红色荧光蛋白重组质粒钙结合蛋白
- “瘤苗”-细胞因子基因转导人肝癌和胃癌细胞的研究
- 陈诗书钱关祥张腾飞钱书兵胡亮徐荣婷程枫孙洁提孙欲晓王立群许伟榕朱敏杨红英厉兴君王克敏
- 将人源hIL-2，hINF-γ，hGM-CSF，hTNF-α等cDNA经逆转录病毒载体转导人肝癌和胃癌细胞，经分析细胞因子基因已整合至瘤细胞，能表达相应mRNA和蛋白质，并具有细胞因子的活性，而且不含复制潜能的病毒，也无...
- 关键词：
- 关键词：瘤苗IL-2
- 白细胞介素2基因工程人大肠癌细胞瘤苗的建立及鉴定
- 2007年
- 目的 建立高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗，并完成相关的实验室鉴定。方法 采用重组逆转录病毒将人白细胞介素2基因转导至三株人大肠癌细胞，G418筛选并挑选单克隆，ELISA检测各单克隆24h白细胞介素2表达量，用Student Newman Keuls检验三株细胞白细胞介素2的表达差异，PCR、Southern blot检测白细胞介素2基因整合，RT-PCR、Northern blot检测白细胞介素2基因转录水平。结果 获得72株G418抗性单克隆，其中表达量最高者为COL0205达138.01ng/L×10^7/24h，统计显示COLO205与SW1116、HT-29组间相比差异有统计学意义（P〈0.05），白细胞介素2基因整合至细胞基因组中，未发生重组或部分缺失，且获得成功表达。结论 本研究成功建立了高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗。
- 陈强赵任程枫王克敏胡亮张治进郁宝铭
- 关键词：大肠癌白细胞介素2细胞瘤苗基因转导
- 人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达
- 2006年
- 目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b(+)构建成重组质粒pET42b(+)-RGN。将pET42b(+)-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2+亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b(+)-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b(+)原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。
- 徐洪胡亮倪培华吴洁敏赵涵芳
- 关键词：REGUCALCIN原核表达
- 葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞内钙离子浓度动态变化及其信号传导途径的研究
- 2008年
- 目的:探讨葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)内钙离子(Ca2+)浓度的动态变化及其信号转导途径。方法:在葡萄糖诱导的HK-2细胞中加入不同浓度的蛋白激酶C抑制剂(Hypericin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Apopain)、蛋白酪氨酸激酶抑制剂(Genistein)、一氧化氮合酶抑制剂(NAME),利用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察HK-2细胞内[Ca2+]动态变化。结果:LSCM下观察发现,150mmol/L葡萄糖可引起HK-2细胞内[Ca2+]增高。150mmol/L葡萄糖诱导的HK-2细胞中加入10-4mmol/LHypericin、10-6mmol/LApopain、10-7mmol/LGenistein、10-2mmol/LNAME可抑制葡葡萄糖诱导的HK-2细胞内[Ca2+]增高。结论:葡萄糖作用于HK-2细胞,可引起细胞内[Ca2+]增高;蛋白激酶C、caspase-3、蛋白酪氨酸激酶、一氧化氮(NO)均参与了葡葡萄糖诱导的HK-2细胞内[Ca2+]增高的信号传导过程。
- 胡亮倪培华徐洪赵涵芳吴洁敏钱关祥
- 关键词：信号传导
- DRAM基因真核表达载体的构建及其表达对HepG_2细胞的作用
- 2009年
- 目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用。方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察DRAM的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期和死亡细胞,MTS法检测细胞增殖能力,Westernblot鉴定细胞表达蛋白质的水平,并在透射电子显微镜下观察自噬体。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-DRAM,经DNA测序证实与GenBank中的人DRAM cDNA序列一致。LSCM下可观察到转染DRAM的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞分析仪检测显示,转染DRAM的HepG2死亡细胞明显增高(P<0.05);G1期细胞百分数则明显减少(P<0.05);MTS法检测结果显示转染DRAM的HepG2细胞增殖力明显增高(P<0.05);Western blot检测到DRAM蛋白表达明显增高;转染pEGFP-N1的HepG2细胞超微结构基本正常,转染DRAM的一些细胞中可见自噬体。结论:本研究成功构建了表达DRAM的真核质粒,并在HepG2细胞中表达,DRAM在肿瘤细胞存在双向效应,既可诱导HepG2细胞发生自噬性死亡,又可促进HepG2细胞增殖。
- 倪培华徐洪胡亮胡翊群姜叙诚
- 关键词：DRAM自噬细胞凋亡
