顾永清
- 作品数：61 被引量：141H指数：6
- 供职机构：南华大学公共卫生学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家杰出青年科学基金上海市现代生物与新药产业发展基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- Naa10基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对口腔鳞癌细胞生长的影响被引量：2
- 2017年
- 目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10,Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功,pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×10~9 TU/mL和1.0×10~9 TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。
- 杨洋郑军徐江顾永清黄瑾王丹妮朱茂祥曾妍
- 关键词：慢病毒RNA干扰口腔鳞癌
- 盐诱导激酶2对电离辐射诱导的自噬与凋亡的影响被引量：2
- 2017年
- 为探索盐诱导激酶2(salt-inducible kinase 2,SIK2)对电离辐射引起的自噬与凋亡的影响,以期为肿瘤的放射治疗提供新的思路,以慢病毒颗粒LV-GFP和LV-SIK2体外转染He La细胞,48 h后用荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测转染细胞SIK2的干扰效果。通过Western blot检测SIK2低表达对8Gy60Coγ射线照射下细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62表达的影响来观察自噬的变化;利用流式细胞术来检测SIK2低表达对8 Gy60Coγ射线照射下细胞凋亡的影响。结果表明,SIK2低表达的稳转细胞系被成功构建;8Gyγ射线照射后,SIK2低表达细胞系LC3-Ⅱ表达下调,P62表达上调,表明自噬被减弱;流式细胞术检测发现SIK2低表达细胞系在照后12 h FITC+PI-细胞比例就显著增加,表明SIK2低表达增加了细胞凋亡。因此,SIK2低表达会导致电离辐射引起的细胞自噬大大减弱,凋亡显著增加。
- 李超李忠秋李雪萍杨洋曾妍潘秀颉杨陟华朱茂祥顾永清
- 关键词：电离辐射自噬凋亡肿瘤放疗
- CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定
- 2014年
- 目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。
- 徐涛张金莉曾妍王攀郎慧芳万传君顾永清
- 关键词：融合蛋白蛋白表达纯化
- 急性砷染毒的L-02细胞的基因芯片分析被引量：4
- 2003年
- 目的 用基因芯片分析急性砷染毒时人正常肝细胞 (L 0 2细胞 )基因表达谱的变化。方法 亚砷酸钠染毒L 0 2细胞 2、15、2 4h与未染毒的L 0 2细胞作表达谱基因芯片杂交。结果 L 0 2细胞用砷剂染毒后不同时间基因表达谱不同。hCYR6 1基因在细胞染毒 2h后就表达增加 ,而在 15h和 2 4h后均不再升高 ;在细胞染毒后的不同时段 ,细胞金属硫蛋白Ⅳ及金属硫蛋白Ⅲ同源基因的表达均显著增加 ;热休克蛋白 86基因在细胞染毒 2h未增加 ,在 15h和2 4h表达均增加。结论 细胞接触砷毒后进入应激状态 ,合成最必需的与解毒功能相关的蛋白 。
- 顾永清杨磊王国荃袁秉祥潘泽民应康李遥谢毅
- 关键词：L-02细胞基因芯片肝细胞亚砷酸钠
- 电离辐射下调miR-34a-5p促进辐射诱导的肺上皮间质转化被引量：3
- 2020年
- 目的探究辐射下调miR-34a-5p在辐射诱导上皮间质转化(EMT)中的作用及其机制。方法Western blotting和流式细胞术检测60Coγ射线照射后肺上皮细胞中EMT相关标志蛋白的表达变化;RT-qPCR检测60Coγ射线照后不同时间点A549细胞和BEAS-2B细胞中miR-34a-5p的表达;将miR-34a-5p过表达或敲低后,Western blotting检测辐射诱导时EMT的表达。生物信息学预测miR-34a-5p的靶基因,RT-qPCR和Western blotting检测miR-34a-5p对靶基因的调控效果。结果6 Gy 60Coγ射线照射后48 h肺上皮细胞发生EMT,RT-qPCR检测显示miR-34a-5p表达下调;过表达miR-34a-5p可逆转辐射诱导的EMT,下调表达miR-34a-5p时,CD44表达升高,并且促进电离辐射诱导的EMT。结论60Coγ射线下调miR-34a-5p促进辐射诱导肺上皮细胞发生EMT,提示miR-34a-5p可能抑制辐射诱导EMT及放射性肺纤维化,有望成为放射性肺纤维化防治的新靶点。
- 王铎刘政刘晓畅顾永清顾永清
- 关键词：MICRORNACD44上皮间质转化电离辐射
- 信号传导及转录激活子3通路参与卷烟烟气凝集物诱导永生化人支气管上皮细胞的恶性转化被引量：1
- 2016年
- 目的检测肺鳞癌组织、鳞状细胞不典型增生组织和癌旁组织中磷酸化信号传导及转录激活子3(p STAT3)蛋白的表达,比较其表达与吸烟的关系;探讨STAT3通路在烟草诱导细胞恶性转化过程中的作用。方法免疫组化法检测288例肺鳞癌组织、108例鳞状细胞不典型增生组织、112例癌旁组织中p STAT3蛋白的表达,比较其表达与吸烟的相关性。构建卷烟烟气凝集物(CSC)诱导第10,20,30,40,50,60及70代细胞(P10,P20,P30,P40,P50,P60及P70)永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化模型。从血清抗性及锚着独立性等方面对CSC诱导各代BEP2D细胞的恶性转化特征进行鉴定。Western蛋白印迹法检测CSC诱导各代BEP2D细胞中p STAT3的表达。MTT法和流式细胞术分别检测JSI-124 0.25~10μmol·L^(-1)对P70细胞存活及凋亡的影响。JSI-124处理CSC诱导P70 24 h后检测存活蛋白表达的变化。结果 p STAT3蛋白在肺鳞癌组织中表达高于鳞状细胞不典型增生和癌旁组织(P<0.05);p STAT3在目前吸烟者中的表达均高于曾经吸烟者和从不吸烟者(P<0.05),且随着吸烟指数增加两者表达水平逐渐升高(P<0.01)。随着转化代数的增高,细胞血清抗性增加,锚着独立性增强,P30细胞以后尤为明显。p STAT3在正常对照组和乙醇对照组中弱表达,且两者之间无显著性差异;CSC诱导的各组BEP2D细胞中,p STAT3的表达均显著高于正常对照组和乙醇对照组(P<0.05),并随细胞代数的增高而增高。JSI-124抑制P70细胞增殖、促进P70细胞凋亡呈浓度及时间依赖性。JSI-124 1μmol·L^(-1)作用P70细胞24 h后,存活蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 STAT3信号通过调控存活蛋白表达抑制细胞凋亡,参与烟草诱导永生化人支气管上皮细胞的恶性转化。
- 袁娜娜李伟陈余清张佳秀洪磊蒋鹏周继红王效静朱茂祥潘秀颉杨陟华顾永清
- 关键词：永生化人支气管上皮细胞
- 人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备被引量：1
- 2008年
- 目的:表达纯化人类PIF1解螺旋酶C-末端的338-641氨基酸的多肽PIF338-641,同时用纯化蛋白制备特异抗体。方法:从HeLa细胞的cDNA文库中PCR扩增得到PIF1解螺旋酶C-末端1012-1926的cDNA片段(对应氨基酸338-641),插入N-末端融合有六聚组氨酸的表达载体pET15b产生pET15b-PIF338-641重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,使PIF338-641蛋白在大肠杆菌中表达,用自制的镍亲和柱纯化PIF338-641蛋白,并以纯化蛋白免疫家兔制备抗血清。结果:PIF338-641蛋白在大肠杆菌中成功表达,纯化了PIF338-641蛋白并制备了PIF338-641蛋白抗血清。结论:制备的PIF338-641蛋白抗体能与蛋白发生特异的免疫反应。
- 顾永清Kenji Kamiya
- 关键词：蛋白纯化抗体制备
- Pif1解旋酶家族功能的研究进展
- 2013年
- 解旋酶是一种所有生物体都广泛存在的酶,对于几乎所有的核酸代谢都是必需的。Pif1解旋酶家族存在于所有的真核生物,是5'-3'方向依赖ATP的解旋酶。Pif1解旋酶影响端粒、核糖体和线粒体的DNA复制以及冈崎片段的成熟,其影响机制很多是利用其解螺旋活性破坏核蛋白复合体的稳定性。不同的生物Pif1解旋酶功能不同,但其对细胞核和线粒体基因组稳定性的维持是非常重要的。目前已知,酿酒酵母(ScPif1和ScRrm3)、裂殖酵母(SpPfh1)、布氏锥虫(TbPIF1、2、5、8)、小鼠(mPif1)和人类(hPif1)均属于Pifl解旋酶家族,现对上述Pifl解旋酶进行综述。
- 王攀顾永清
- 关键词：DNA复制
- 恶性肿瘤组织的端粒酶活性分析
- 2003年
- 目的 :检测端粒酶活性在恶性肿瘤和良性肿瘤及正常组织的表达 ,以探讨端粒酶活性对恶性肿瘤检测的意义。方法 :采用端粒重复序列扩增分析法 (telomericrepeatamplificationprotocolassay ,TRAP)检测 87例恶性肿瘤和 4 7例对照组织中端粒酶的活性。结果 :恶性肿瘤端粒酶活性阳性检出 85 .0 6 % (74 / 87) ,明显高于对照组织 ,(P<0 .0 1) ;端粒酶活性与组织类型无明显相关性。结论 :与对照组织相比 ,恶性肿瘤组织中端粒酶活性明显升高 。
- 顾永清何玲潘泽民周祖钊
- 关键词：恶性肿瘤端粒酶活性
- 骨质疏松治疗药物的研究进展被引量：42
- 2014年
- 骨质疏松是一种以骨量减少和骨组织微结构破坏为特征,并能导致骨脆性增加和易于骨折的全身性疾病.目前治疗该病的主要目的是预防骨折的发生,但仍没有特效药.在治疗骨质疏松的3类药物中,骨吸收抑制剂是当前的主要药物,它通过抑制骨的重吸收来提高骨密度;骨形成促进剂可以直接刺激骨形成,并且有重建骨组织的效应;骨矿化物是防治骨质疏松的基础药物,包括钙剂和维生素D.然而,随着科学研究的不断深入,出现了一些新的治疗理念和策略,靶向治疗成为未来药物的发展趋势.当前以RANKL信号通路和Wnt信号通路的研究为依据的各种骨生长因子制剂(如denosumab,sclerostin antibody等)逐渐被开发,疗效也较好.另外,BMP信号通路作为骨生长的重要调节通路,其刺激骨形成的作用十分突出,且在该通路的调节蛋白中存在较多潜在靶点,如Smurf1,CKIP-1等.这在靶向治疗骨质疏松的新药研发领域值得深入探讨.
- 汪呈曹宇顾永清张令强
- 关键词：骨质疏松骨吸收抑制剂骨形成促进剂WNT信号通路
