为探明肺巨噬细胞在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引致肺炎过程中发挥的作用,用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),首先以10倍递增的SS2∶PAM感染比(MOI)分别为1∶10～1 000∶1感染12h;其次以MOI=100∶1分别感染1、2、4、6、12、24h,ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的质量浓度及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,与对照组之间均差异极显著(P<0.01),菌液浓度之间和时间点之间均差异显著(P<0.05);同时PAM的形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损细胞或濒死细胞产生。MOI为1∶1感染12h,或MOI为100∶1感染6h的条件下均可致70%的PAM崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100∶1,感染12h,此时镜下细胞几乎全部崩解死亡,表明PAM的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而开始。结果表明,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。
为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。
