刘卫滨
- 作品数：12 被引量：182H指数：8
- 供职机构：中国疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划云南省应用基础研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Banna病毒TaqMan探针法RT-PCR检测方法的建立被引量：11
- 2006年
- 目的建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法。方法首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计。病毒在BHK21细胞或C6/36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录。以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测,并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价。结果Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性,可以检出所有12株Banna病毒,而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、batai病毒和环状病毒检测结果均为阴性。与传统PCR相比,敏感性高100倍以上,可以检出每50μl标本中含有0·5CCID50的Banna病毒。单链RNA变性条件(65℃)进行逆转录使检测结果的敏感性比99℃变性法最少低10倍。病毒在室温保存1天和4℃保存1周后,检出敏感性会比原来低10倍左右。该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时,均显示出较好的特异性。112份蚊标本中检出6份标本阳性,4份可疑阳性,病毒分离结果3份阳性。结论本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法,并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测,为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段。
- 徐丽宏曹玉玺何丽芳王焕琴何英付士红孙肖红王环宇刘卫滨王力华梁国栋
- 关键词：虫媒病毒聚合酶链反应
- 河北省虫媒病毒分离鉴定被引量：34
- 2006年
- 目的 研究河北省蚊虫携带虫媒病毒情况。方法 在蚊虫孳生地采集标本液氯保存，按照20—30只／组经无菌处理后研磨，研磨液离心后接种C6／36细胞，连续三代观察致细胞病变情况；对细胞病变阳性的分离物，进行血清学和分子生物学鉴定。结果 在河北省涉县两个村共采集蚊虫1310只，分46组进行处理，共获得13株阳性分离物，其中两株分离物经间接免疫荧光检测提示为甲病毒属成员，用甲病毒属特异性引物RT-PCR扩增阳性，经核酸序列测定证实该序列与Getah病毒（AY702913．1）同源性最高（98％），初步鉴定为Getah病毒，其他病毒分离物尚在鉴定。结论 本研究从河北省蚊虫标本中分离到Getah病毒，这是我国内陆地区首次分离到该病毒。
- 王焕琴刘卫滨杨冬荣梁勇王俊巍张连山刘家伟陶三菊吕新军梁国栋
- 关键词：虫媒病毒
- 辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定被引量：46
- 2006年
- 目的 对2002年辽宁省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 从辽宁省采集蚊虫标本4927只，用细胞培养的方法分离病毒，对新分离的病毒进行血清学（ELISA和IFA方法）、分子生物学鉴定。结果 本实验共研磨蚊虫标本50批，分离到2株病毒，命名为LN02-102、LN02，104。这2株病毒均可致BHK-21细胞病变（CPE）（2—3d），致Vero细胞病变（2—4d），也可致C6／36细胞病变（2—4d）。对3日龄乳鼠2—3d可致死。这2株病毒可与标准乙脑病毒抗体反应。利用病毒PrM区段（基因组456-695核苷酸）进行基因分型分析。新分离的2株病毒属于基因Ⅰ型乙脑病毒。对这2株病毒的E基因区段进行分析，它们之间核苷酸和氨基酸的同源性为100％，与疫苗株SA14-14-2相比，核苷酸差异为4．11％，氨基酸差异在0．60％。结论 在辽宁省采集的蚊虫标本中分离到2株病毒，经血清学和分子生物学鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒，是近年来在辽宁省首次分离到基因Ⅰ型的乙脑病毒。
- 王俊文付士红王环宇毛晓燕刘卫滨何英孙肖红蔡增林吴立平赵习芳韩瑞红景雅梁国栋
- 关键词：种系发生基因
- 在我国北方涉县首次检测到盖塔病毒被引量：5
- 2010年
- 目的:确定从河北省涉县蚊体中分离到的病毒种类。方法:采集三带喙库蚊标本,液氮运输和保存,10只为一组研磨后接种C6/36细胞分离病毒。病毒株分别采用乙醚试验、免疫荧光试验和分子生物学试验进行毒株鉴定。结果:采集到蚊标本1290只,标本处理后接种细胞47批,病毒分离结果得到13株阳性分离物(毒株),经乙醚试验和免疫荧光试验初步鉴定HB0215-3和HB0234两株病毒为披膜病毒科甲病毒属成员,再经RT-PCR、核酸序列测定和分析,证实两株病毒核酸与国际基因库中的AY702913和NC-006558盖塔病毒同源性最高,被进一步鉴定为盖塔病毒。结论:该研究从河北省涉县三带喙库蚊中分离到了盖塔病毒,这是我国内陆地区北方首次分离到。
- 梁勇张连山刘永为王峻巍董运强王志强王焕琴翟友刚刘卫滨杨冬荣陶三菊梁国栋
- 关键词：盖塔病毒甲病毒属病毒分离
- 乙型脑炎病毒TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用被引量：25
- 2005年
- 目的利用TaqMan PCR技术,建立乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)实时荧光PCR检测方法,初步应用于蚊虫媒介的JEV监测。方法根据GenBank发表的JEV全基因组序列资料分析结果,在其NS5基因区段设计JEV特异的引物与探针;优化Mg2+浓度和引物浓度比例,并利用11株JEV和7株相关病毒株考核检测体系的保守性、特异性、灵敏性和稳定性;利用体外转录的病毒RNA和定量的病毒样品,建立相应的定量分析模型;初步应用于蚊虫媒介的监测与检测分析。结果Mg2+优化浓度为5mmolL,上下游引物浓度比例为4∶1,引物探针具有良好的保守性和特异性,灵敏度为10PFUml,稳定性分析表明,同一样品Ct值的重复检测5次,变异系数均小于5%;绘制两种标准曲线,构建了JEV基因拷贝数、病毒滴度为分析指标的定量分析模型,检测蚊虫标本结果显示,TaqMan PCR方法较病毒分离法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的JEVTaqMan PCR检测方法,为蚊虫媒介检测奠定了基础,为乙型脑炎的预防控制和脑炎相关疾病的诊断与鉴别诊断提供了一种技术手段。
- 刘卫滨付士红宋宏王环宇曹玉玺何英王俊文王力华梁国栋
- 关键词：乙型脑炎病毒TAQMANPCRPCR检测方法ENCEPHALITISMG^2+
- 血管抑制素和内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达与鉴定被引量：2
- 2006年
- 血管抑制素(A S)和内皮抑制素(ES)是两种具有较强活性的内源性血管抑制剂,联合应用具有协同作用。本研究通过大肠杆菌表达A S-ES融合蛋白,观察其对血管生成的抑制作用。首先用RT-PCR方法分别获得A S和ES基因,通过基因拼接获得融合基因,构建了含有该融合基因的原核表达质粒——pET-42(b)/A S-ES。表达菌株经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体形式表达,表达量为14%,分子量约65 KD。W estern b lotting检测表明表达产物可分别与A S和ES抗体产生特异的免疫反应。经复性、肝素亲和层析柱纯化的表达产物对鸡胚尿囊膜血管有明显抑制作用。本研究获得了A S、ES在大肠杆菌中的融合表达,目的蛋白具有特异的免疫反应性和血管抑制活性。
- 毛晓燕刘卫滨付士红李仁德梁国栋
- 关键词：血管抑制素内皮抑制素原核表达包涵体
- 云南省虫媒病毒的分离鉴定被引量：38
- 2005年
- 目的了解云南省部分地区虫媒病毒的存在及流行情况。方法2002年和2004年从云南省5个县市采集蚊虫,经研磨、细胞接种分离病毒,通过实时荧光PCR、免疫荧光试验等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特性进行分析。结果采集到4810只蚊虫,分离到12株致BHK细胞病变的病毒,经实时荧光PCR、免疫荧光试验等鉴定为乙脑病毒。新分离病毒DL0437属于基因Ⅲ型乙脑病毒。结论2002年和2004年在云南5个县市采集4810只蚊虫中分离到12株乙脑病毒,是近年来在云南省首次分离到基因Ⅲ型乙脑病毒。
- 孙肖红付士红张海林王环宇何英刘卫滨杨卫红冯云闽继光韩瑞红梁国栋
- 关键词：虫媒病毒基因型
- 我国首次分离巴泰病毒的分子生物学鉴定被引量：16
- 2005年
- 目的对从云南蚊虫中分离的YN924病毒进行分子生物学鉴定,从分子生物学水平明确其分类地位。方法扩增YN924病毒的S片段并测序,通过ClustalX(1.8)、Phylip、Treeview(3.2)软件对S片段的序列进行分析,并构建种系发生树;对S片段编码产物N蛋白及NSs蛋白的氨基酸顺序进行分析。结果用两对引物均可从YN924病毒扩增出产物,序列分析发现S片段与巴泰病毒(X73464)的同源性最高,为96.4%;N蛋白、NSs蛋白的氨基酸顺序与巴泰病毒的同源性分别为99.1%和98%。结论从云南分离的YN924病毒属于巴泰病毒,我国首次对该病毒进行分子生物学鉴定。
- 付士红孙肖红王环宇曹玉玺王焕琴刘卫滨陶三菊梁国栋
- 关键词：种系发生
- 辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立被引量：3
- 2005年
- 目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法。方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBRGREENΙ荧光PCR和常规RTPCR扩增,并对SYBRGREENΙPCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃,最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBRGREENΙ荧光PCR方法进行检测。结果SYBRGREENΙ荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1PFU/ml。对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响。对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性。结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段。
- 何丽芳徐丽宏曹玉玺王力华刘卫滨付士红梁国栋
- 关键词：逆转录聚合酶链反应
- 狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立被引量：11
- 2006年
- 目的建立检测狂犬病毒(RV)核蛋白(N)基因片段的TaqMan PCR检测方法。方法针对RV N基因保守区域设计特异性引物与探针;优化检测体系中引物与探针的浓度;以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型;考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性;初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性,使用浓度分别为0．6μmol/L和0．2μmol／L,可检测到2700个RNA拷贝数,较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍;同一样品Ct值重复检测5次,变异系数均<5％,表明检测体系具有较好的稳定性;通过所建立的检测体系,绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线,对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测,并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。
- 张强唐青刘卫滨李浩梁国栋
- 关键词：狂犬病毒TAQMANPCR检测
