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杨阳: 作品数：14 被引量：10H指数：2; 供职机构：华中科技大学同济医学院附属协和医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家杰出青年科学基金“十一五”国家科技支撑计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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人SPK1基因的重组腺病毒载体感染效率及表达特性研究: 2012年; 目的研究重组腺病毒载体感染小鼠神经瘤细胞(N2a)的感染效率及重组腺病毒介导的人鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)基因在N2a细胞表达特性。方法用流式细胞仪检测感染效率,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;用Western blot方法检测SPK1蛋白的表达。结果 N2a细胞的感染效率和绿色荧光蛋白表达量在一定范围内随着病毒感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的增加而增高,MOI为100时感染效率达峰值为(99.57±0.133)%。以MOI为25的重组腺病毒感染N2a细胞,感染效率随时间变化(0-72h)而增高,72h峰值为(98.03±0.721)%,到96h有所降低(P<0.05)。SPK1蛋白的表达量较感染空病毒组和未感染病毒组明显升高。结论重组腺病毒在适宜的MOI下,在N2a细胞中96小时内均有较高的感染效率,且重组腺病毒介导的人SPK1基因在体外能够得到有效的表达。; 杨阳马嵘张远刘郁东汪敏孙圣刚黎钢; 关键词：重组复制缺陷型腺病毒鞘氨醇激酶-1

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究: 2009年; 目的通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究，筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体。方法一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液，通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较。结果血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达。rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多，第60天仍可检测到高表达。rAd5携带的EGFP蛋自在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天，在30天时表达明显减弱。结论腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效，而腺相关病毒载体以其长的表达时程，低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势。; 杨阳孔维佳胡钰娟钟毅赵学艳彭炜; 关键词：腺病毒腺相关病毒增强型绿色荧光蛋白内耳

病毒与非病毒载体转染新生大鼠血管纹边缘细胞的比较研究: 2008年; 目的通过病毒与非病毒载体对原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞转染情况的比较,选择出适合边缘细胞的基因治疗载体。方法用质粒(pEGFP-N1)、血清5型重组腺病毒(rAd5)以及血清2型重组腺相关病毒(rAAV2)三种载体转染新生大鼠(≤72小时)耳边缘细胞,通过对转染效率、细胞凋亡以及细胞活性的检测将三种载体加以比较。结果对边缘细胞的转导效率依次为rAd5>rAAV2>pEGFP-N1,AnnexinⅤ-APC/7-AAD双染法检测转染阳性细胞的损伤情况依次为rAAV2rAd5>pEGFP-N1。结论病毒载体相对于非病毒载体以其高转导效率、低细胞毒性在对原代培养的新生大鼠耳边缘细胞的转染中表现出明显优势。与血清2型重组腺相关病毒比较,相对高效、低毒性的血清5型重组腺病毒更适用于原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的基因转染研究。; 杨阳孔维佳李隽胡钰娟钟毅郝亚楠赵学艳彭炜; 关键词：转染边缘细胞

重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶转染大鼠耳蜗血管纹缘细胞的研究: 2008年; 目的探讨以重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus of the serotypes2,rAAV2)为载体对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells,MCs)转染锰超氧化物歧化酶(Manganese SuperoxideDismutase,MnSOD),获得高表达MnSOD转基因缘细胞的可行性。方法实验组按感染复数(MOI)为104v.g./cell对体外培养的血管纹缘细胞转染rAAV2-MnSOD-EGFP,同时设转染rAAV2-EGFP缘细胞作为空载对照组,未转染细胞为空白对照组。荧光显微镜下每2d观察1次MCs的绿色荧光蛋白(Enhenced green fluorescentprotein,EGFP)表达情况。比色法测定各组MCs的MnSOD活性。激光共聚焦显微镜下观察转染rAAV2-MnSOD-EGFP后MnSOD的表达,免疫印迹法(Western blot)定量分析MnSOD的表达。结果(1)各组MCs转染后,生长正常,空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP后2天开始出现微弱EGFP的表达,1周后至高峰;实验组转染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EGFP的表达,10d至高峰,且持续表达于细胞培养的整个期间。EGFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色,弥漫于整个胞质。(2)对激光共聚焦显微镜及Westernblot的检测结果进行分析,实验组较空载对照组和空白对照组的MCs中MnSOD的表达明显升高,差异有统计学意义。结论rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs并持续高表达MnSOD。; 李隽杨阳孔维佳胡钰娟; 关键词：血管纹缘细胞锰超氧化物歧化酶转染

聚ADP核糖聚合酶1表达下调对葡萄糖氧化酶诱导的边缘细胞损伤的保护作用研究: 张园园杨阳孔维佳

蝶枕部骨纤维异常增殖症1例并文献复习被引量：3: 2008年; 目的:探讨颅骨的骨纤维异常增殖症的临床表现、影像学特征、病理学改变、诊断和治疗。方法:报告1例蝶枕部骨纤维异常增殖症并复习文献。结果:颅骨的骨纤维异常增殖症以头痛、眼球突出、复视甚至失明等为主诉。其CT特征为"毛玻璃样变",骨纤维畸形、硬化及黏液囊性变。病理学检查可明确诊断,而其影像学的特征性改变也可为诊断提供有力的证据。结论:颅骨的骨纤维异常增殖症临床表现多样,容易误诊,需结合临床表现、影像学及病理学检查结果进行诊断。对骨纤维异常增殖症患者手术治疗应当慎重,以保留残存的功能为首要目的。; 刘珺孔维佳王彦君杨阳俞燕萍吴媛媛; 关键词：骨纤维异常增殖症电子计算机断层摄影术磁共振成像

锰超氧化物歧化酶基因转染对大鼠内耳的抗氧化保护被引量：1: 2009年; 目的探讨外源性锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）基因表达对拟老化模型大鼠内耳氨基糖苷类抗生素损伤的保护作用。方法雌性SD大鼠按150ms／（kg·d）给于半乳糖皮下注射连续8周，制备拟老化大鼠模型；在第9周按500mg／（kg·d）给于阿米卡星腹腔注射连续1周，制备氨基糖苷类损伤大鼠模型。将携带MnSOD基因的重组腺相关病毒（rAAV2-MnSOD）液经蜗窗膜注入拟老化大鼠或氨基糖苷类损伤大鼠的耳蜗外淋巴，通过免疫组化凋亡检测、耳蜗基底膜铺片、caspase-3蛋白测定、酶活性测定和听性脑干反应（ABR）检测等方法观察MnSOD基因在对抗内耳氧化应激损伤中的作用。结果外源性MnSOD基因的转染使得内耳MnSOD从基因和蛋白水平的表达均得到了有效提升（P值均〈0．05），减少了氨基糖苷类抗生素损伤后氧化应激导致的拟老化大鼠内耳细胞的凋亡。结论外源性MnSOD基因能部分对抗氨基糖苷类抗生素所致氧化应激对拟老化大鼠内耳的损伤。; 杨阳孔维佳胡钰娟李隽钟毅赵学艳郝亚楠彭炜; 关键词：内耳超氧化物歧化酶转染氨基糖苷类氧化性应激

耳蜗疾病基因治疗载体: 2008年; 在人类基因组计划的推动下，基因治疗已成为最有希望的治疗策略，在耳聋康复方面，基因工程技术也是一种很有前景的实验和临床治疗手段。基因治疗研究的快速发展对基因导入系统提出了越来越高的要求。本文对近年来常用的耳蜗基因治疗载体进行综述。; 杨阳孔维佳

pEGFP-N1/MnSOD重组质粒的构建及体外表达被引量：1: 2007年; 目的:构建大鼠源性锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD,并检测其在原代培养的大鼠耳蜗血管纹边缘细胞中的表达。方法:从大鼠心肌组织中扩增出SOD基因,克隆入融合表达载体pEGFP-N1中,用脂质体法转染大鼠耳蜗血管纹边缘细胞,激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白及目的基因的表达,流式细胞仪检测转染效率。结果:构建了大鼠源性MnSOD基因真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD,并观察到转染/感染48h后,绿色荧光蛋白及目的基因在大鼠耳蜗血管纹边缘细胞中表达,目的基因的转染效率为23.47%。结论:成功构建了大鼠源性MnSOD基因真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD,并使目的基因成功在大鼠耳蜗血管纹边缘细胞中表达,为内耳抗氧化基因治疗奠定了基础。; 杨阳孔维佳; 关键词：锰超氧化物歧化酶边缘细胞

携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响被引量：1: 2012年; 应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1-siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒(pBHG loxΔE1,3 Cre)共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度;病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达;Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E+10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达;SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加(P<0.001)。上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加。; 杨阳马嵘张远吕冰洁汪敏孙圣刚黎钢; 关键词：RNA干扰腺病毒载体

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