林秀坤
- 作品数：15 被引量：50H指数：4
- 供职机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金转基因生物新品种培育专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 植酸酶转基因猪成纤维细胞系的构建被引量：2
- 2013年
- 本研究旨在获得对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性的植酸酶转基因猪成纤维细胞系。本研究首先检测了转植酸酶基因的酵母发酵液分别经不同浓度、pH2.0的胃蛋白酶和不同浓度、pH7.0的胰蛋白酶处理后的酶活残余量;然后采用流式细胞术筛选了慢病毒转染的阳性猪成纤维细胞,并进行鉴定。结果表明,酵母粗酶液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,残留酶活分别保持在70%和80%以上;包装后的慢病毒滴度为3.75×107,经流式细胞术筛选的转基因细胞阳性率为1.2%,PCR和RT-PCR结果表明,植酸酶基因已整合到基因组上,且该基因在转录水平上表达。本研究为制备植酸酶转基因细胞系提供了一种快速有效的方法,为转基因猪的培育奠定了基础。
- 陈晓亮黄怡殷丽丽王士长林秀坤
- 关键词：转基因植酸酶慢病毒
- 牛性别决定新基因Fgf9的克隆及生物信息学分析被引量：3
- 2009年
- Fgf9基因是脊椎动物性别决定中重要的信号因子,它在睾丸发育过程中参与Sertoli细胞的增殖和睾丸索的形成。基于表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆原理,采用序列拼接和RT-PCR方法获得了荷斯坦奶牛Fgf9基因的cDNA序列,并对其组织表达特征进行分析。利用生物信息学方法对Fgf9基因序列和蛋白结构进行分析。结果显示:Fgf9基因定位于牛12号染色体上,cDNA全长为697bp,开放阅读框为627bp,编码208个氨基酸,分子量23.38245kDa,等电点7.0600。RT-PCR证实该开放阅读框正确,在牛的各组织中均有表达,且与牛其他cDNA无同源性,获得GenBank登陆号为:EU693028。功能结构分析显示Fgf9蛋白具有典型的FGF家族保守结构域,包括受体相互作用位点和肝素结合位点。信号肽预测显示牛Fgf9蛋白可能不存在信号肽序列。
- 廖冰吴宁韩凤桐林秀坤
- 关键词：性别决定基因克隆生物信息学
- 崂山奶山羊Myostatin基因真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的表达研究被引量：2
- 2012年
- 试验克隆了崂山奶山羊Myostatin基因序列,构建了其真核表达载体,并验证了其在成纤维细胞中的表达。本研究通过从崂山奶山羊肌肉组织中提取RNA,反转录后采用巢式PCR方法扩增出Myostatin基因序列,构建真核表达载体,通过转染成纤维细胞,采用RT-PCR方法验证其表达。结果表明,克隆出崂山奶山羊Myostatin基因的全长cDNA序列,大小为1128bp,GenBank登录号:GU377303.1;构建pcDNA-MSTN真核表达载体,转染成纤维细胞48h后通过RT-PCR检测,结果显示,Myostatin表达量显著增加,表明成功构建pcDNA-MSTN真核表达载体,为进一步研究Myostatin的生物学功能及转基因羊培育奠定基础。
- 唐大运陈晓亮吴健敏朱化彬杜卫华王栋赵学明陈汉忠林秀坤
- 关键词：崂山奶山羊肌肉生长抑制素真核表达载体成纤维细胞巢式PCR
- 牛Sry启动子调控序列的鉴定被引量：4
- 2010年
- 【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry、Sox9、Sf-1和Dax1,牛Sry5′端-93、-419和-722处存在3个潜在的转录起始位点(TSS),-599—-565区域35bp内存在控制Sry基础转录活性的顺式调控元件,其中存在多个潜在的转录因子结合位点。【结论】牛Sry5′端UTR区-599—-565bp区域35bp存在部分调控序列。
- 韩凤桐林秀坤刘娣吴宁廖冰
- 关键词：SRY核心启动子
- FGF9调节性腺分化研究进展被引量：3
- 2009年
- 性别决定过程是双潜能胚胎发育成睾丸或卵巢的过程。通过小鼠基因敲除试验以及在遗传水平分析性反转病人证明该过程是由多个基因调控的。论文综述了睾丸发育通路中信号分子成纤维细胞生长因子9(FGF9)在性腺分化中的作用。FGF9基因参与调节早期睾丸发育的3个重要事件,为调节性腺体腔上皮细胞增殖,促进Sertoli前体细胞形成,调节中肾细胞迁移,影响睾丸索的形成,FGF9诱导FGFR2在核内定位,并维持Sox9的表达。
- 廖冰林秀坤
- 关键词：性别决定SERTOLI细胞睾丸发育
- 小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究被引量：9
- 2006年
- 为了研究Sry基因的调控网络,采用siRNA技术使Sry基因沉默,探讨了有效沉默Sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠Sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠Sry基因为靶点的siRNA干涉载体pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第11.5天,即11.5dpc(dayspostcoitum,性交后天数)取出胚胎,采用双重PCR法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量RT-PCR法检测Sry基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对Sry基因表达量的影响.研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为9.5dpc,注射剂量为20μg,注射干扰质粒pSilencer4.1/Sry565对Sry基因的抑制效率达85%左右.结果表明,siRNA可以显著抑制雄性胚胎Sry基因的表达.
- 赵金红杜卫华道尔吉裴杰张丽林秀坤
- 关键词：SIRNASRY小鼠胚胎基因沉默
- siRNA介导Sry基因沉默对小鼠胚胎性别决定基因表达的影响被引量：1
- 2008年
- 为研究Sry基因的调控网络,采用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异性地抑制睾丸决定因子Sry在小鼠胚胎中的表达,并观察Sry基因沉默后对在两性性腺分化中起重要作用的Wt1,Sf1,Dax1,Gata4,Sox9及Amh基因表达的影响。利用本课题组先前构建的siRNA重组表达载体(pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565),通过尾静脉注射法导入妊娠9.5天(9.5dpc)的母鼠体内,在11.5dpc时取胚胎,对性别鉴定为雄性的胚胎以RT-PCR法和Western-blot检测Sry基因的表达抑制效果,并同时用定量PCR法检测Wt1等上述性别决定相关基因表达变化情况。结果表明,注射干扰质粒后48hSry基因的mRNA和蛋白表达水平均降低,其中siRNA表达质粒pSilencer4.1/Sry565的抑制效果显著,可达到80%的抑制率。Sry基因沉默后,Wt1基因表达量显著升高;Sf1,Dax1,Gata4,Sox9基因表达水平没有明显变化;Amh基因无表达。试验结果表明,Sry基因表达抑制会导致Wt1基因表达升高;另外,Sry基因激活Sox9基因的表达可能需要其他的辅助因子协同作用。
- 吴宁林秀坤廖冰杜卫华韩凤桐赵金红
- 关键词：SRY尾静脉注射性别决定基因
- 牛Sry亚细胞定位及其对Sox9基因表达的影响被引量：1
- 2008年
- 为鉴别牛Sry基因的下游目的基因,并确定Sry蛋白在细胞内的定位区域,本试验构建pcDNA3.1-Sry表达载体和pEGFP-N1-Sry亚细胞定位表达载体,在原代培养的生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行Sry过表达,并对性别控制相关基因在Sry过表达前后的表达水平变化进行检测,包括Sf1(Steroidogenic fator-1)、Gata4(GATA binding protein 4)、Wt1(Wilms tumor gene)、Sox9(Sry-related HMG box-9)、Amh(Anti Mullerian Hormone)和Dax1(Dosage sensitive sex reversal locus-1);并在两种细胞中进行了Sry亚细胞定位研究。Sry在两种细胞中过表达后,在生殖嵴细胞中Sox9的表达水平被显著上调,但在卵巢颗粒细胞中未观察到Sox9基因被上调,而其他几个基因的表达水平未受Sry影响;亚细胞定位结果表明牛Sry主要分布在细胞核内。本试验说明牛Sry可能间接调控Sox9表达,或存在其他不需要Sry参与的调控通路调控Sox9表达;牛Sry蛋白起转录因子作用。
- 韩凤桐吴宁廖冰林秀坤刘娣
- 关键词：SRY过表达亚细胞定位SOX9
- 牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定被引量：3
- 2006年
- 利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a(+)载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。
- 裴杰杜卫华刘小林柳向军朱化彬赵金红林秀坤
- 关键词：SRY基因表达纯化奶牛
- SRY基因调控网络的研究进展
- 2010年
- 性别决定过程可能是以SRY基因为主导,由一系列上游或下游基因参入和协调的级联反应过程。研究发现,DMRT1、SOX9、SF1、WT1、LIM1、LHX9和DAX1等基因对动物性别的决定和性器官的分化起着重要作用。本文就SRY及性别相关基因调控网络的研究进展作一综述。
- 赵金红赵金艳黄勇富林秀坤
- 关键词：SRY调控网络
