温晓梨
- 作品数：3 被引量：6H指数：1
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- 小鼠DUSP13＇-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定被引量：4
- 2013年
- 目的建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSP1)3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定。方法提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达。将含有小鼠DUSP1 3'-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响。结果成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体。小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P<0.01);共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P<0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P<0.05)。结论成功构建了DUSP1 3'-UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究。
- 温晓梨孙宏卫欧小利王妮梅柱中姜勇
- 关键词：荧光素酶类基因转录
- 调控DUSP1(MKP-1)基因表达的特异性RNA结合蛋白及microRNA的筛选
- 在哺乳动物细胞中,生长因子或应激刺激可激活多条信号转导通路,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路是其中之一,MAPK包括：细胞外信号调节激酶(ext...
- 温晓梨
- 文献传递
- TRPM2蛋白在大肠杆菌的表达纯化和多克隆抗体制备被引量：1
- 2013年
- 目的获得人瞬时受体电位M2(TRPM2)离子通道蛋白N末端的原核表达融合蛋白,制备兔抗人TRPM2多克隆抗体。方法采用PCR扩增编码人TRPM2蛋白N末端1～334位氨基酸残基(在人与小鼠中高度保守)的cDNA序列,将其克隆至谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-3上。将原核表达重组质粒转化BL2l(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-TRPM2N融合蛋白的表达,并纯化获得相对分子质量(Mr)约70000的GST-TRPM2融合蛋白。将此融合蛋白与弗氏完全佐剂混合后采用经典的4次免疫法免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用Western blot法对该抗体进行鉴定。结果通过PCR扩增获得编码TRPM2蛋白N末端的cDNA片段并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T3中,采用IPTG诱导、蛋白质的变性与复性纯化获得融合蛋白GST-TRPM2N,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备获得特异性抗TRPM2蛋白的多克隆抗体。结论成功制备了特异性抗人TRPM2蛋白的多克隆抗体。
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- 关键词：原核表达蛋白纯化多克隆抗体
