唐晶
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
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- 小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定
- 2012年
- 目的构建携带miR-122的重组慢病毒表达载体,为研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法从小鼠基因组DNA采用PCR法扩增出pre-miR-122基因,测序后克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP逆转录病毒载体上,测序鉴定,病毒包装后,转染NIH3T3细胞,并通过绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒感染肝前体细胞(HPCs),利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒载体pCDH-CMV-miR-122-EF1-copGFP经PCR扩增及测序鉴定正确,并得到了滴度为(1～5)×106IU/mL的病毒液。pCDH-CMV-miR-122-EF1-copGFP感染的肝前体细胞中miR-122表达显著增强。结论成功构建了小鼠miR-122重组慢病毒,并在肝前体细胞中高效表达出miR-122,为进行miR-122的功能和机理奠定了良好的基础。
- 邱荣林邓小耿谢平李治熹唐晶
- 关键词：慢病毒
- miRNA-122促进小鼠胚胎干细胞源性肝前体细胞的分化与成熟被引量：4
- 2013年
- 目的:通过miRNA-122(miR-122)转染胚胎干细胞(ESCs)源性肝前体细胞,观察及评估其是否能推进ESCs向肝细胞的分化过程。方法:采用丁酸钠、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)及地塞米松(Dex)联合序贯诱导小鼠ESCs使之初步分化为肝前体细胞,然后利用Gateway技术构建出pAV.Ex1d-CMV>miR122/IRES/eGFP重组腺病毒表达载体,使其转染贴壁诱导第9天的小鼠ESCs源性肝前体细胞,获得稳定高表达miR-122的细胞后继续培养。采用荧光显微镜观察转染后细胞形态的变化;使用real-time RT-PCR检测肝特异性基因的表达;免疫荧光检测肝特异性蛋白表达水平;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验检测肝细胞功能。结果:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞。转染miR-122后,细胞在形态学上更接近成熟肝细胞;肝特异性基因白蛋白(ALB)、甲状腺素运载蛋白、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞角蛋白8、胆固醇7α-羟化酶及细胞色素P450 3A4的mRNA表达均增高;肝特异性蛋白ALB及细胞角蛋白18均表达增高,而甲胎蛋白表达降低;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验结果均显示转染miR-122后肝细胞功能较对照组明显增强。结论:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞;miR-122能够有效地促进小鼠肝前体细胞的分化与成熟。
- 邓小耿邱荣林伍耀豪李治熹曾乐祥张杰周嘉嘉唐晶邓洁敏
- 关键词：胚胎干细胞肝细胞
- 丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用被引量：3
- 2013年
- 【目的】探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为。【方法】将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclin D1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况。【结果】Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclin D1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达。流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G 2/M期进展。MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加。【结论】HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclin D1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关。
- 唐晶周嘉嘉邓小耿程帝张杰伍耀豪曾乐祥邱荣林陈汝福
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白肝癌STAT3CYCLIND1
