张欢欢
- 作品数：5 被引量：30H指数：3
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- 飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能被引量：5
- 2012年
- 【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA)的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1天至第7天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a(+)蛋白表达载体,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37—50℃,最适pH为8.0—9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200μmol.L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60μmol.L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200μmol.L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43μmol.L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶(GlcNAc kinase)补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc6P),用于几丁质的合成。
- 张欢欢张学尧刘晓健马恩波张建珍
- 关键词：飞蝗原核表达RNA干扰
- 飞蝗GFAT和GNA的分子特性及生物学功能研究
- 几丁质是昆虫表皮及围食膜的重要成分,许多酶参与几丁质的合成。研究昆虫几丁质合成途径关键酶的生物学功能,对于解析昆虫几丁质合成机制具有重要意义。本文选择了飞蝗几丁质合成途径的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶(glutamin...
- 张欢欢
- 关键词：飞蝗
- 文献传递
- 飞蝗可溶型海藻糖酶基因的序列分析及mRNA表达特性被引量：12
- 2012年
- 海藻糖酶是海藻糖代谢过程中的一个关键酶,在昆虫发育和能量调节中具有重要作用,为进一步探讨海藻糖酶基因的功能,本文分析了飞蝗Locusta migratoria一可溶型海藻糖酶基因的氨基酸序列并对其mRNA表达特性进行了研究。结果表明:该海藻糖酶(TRE,GenBank登录号:FJ795020)不含有跨膜结构。系统进化树分析结果显示,该酶与大豆蚜Aphis glycines、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、褐飞虱Nilaparvata lugens和灰飞虱Laodelphax striatella可溶型海藻糖酶具有较近的亲缘关系,因此我们将该酶的基因命名为LmTre-1。对该基因在不同组织和发育时期表达量的荧光定量PCR分析表明:LmTre-1在卵发育前期、中期的表达量都很低,卵发育后期表达量显著提高;LmTre-1在5龄若虫和成虫被检测的组织部位中均有表达,在体壁中的表达量最高,其次是在脂肪体、肌肉、气管、精巢及卵巢中;5龄飞蝗刚蜕皮后LmTre-1在体壁中的表达量较高,随着生长发育其表达量逐渐降低;LmTre-1在成虫发育期体壁中稳定高表达。LmTre-1的mRNA表达特性与几丁质合成酶1基因非常相似,据此推测该基因可能与体壁几丁质的合成相关。本研究为深入探讨该基因的生理功能提供了重要的基础数据,并为以海藻糖酶为杀虫靶标的农药筛选奠定实验基础。
- 刘晓健张欢欢李大琪崔淼马恩波张建珍
- 关键词：飞蝗海藻糖酶实时荧光定量PCRMRNA表达
- 古直《重定陶渊明诗笺》研究
- 古直先生是现代学术史上全面笺注陶诗的第一位学者，在陶渊明享年和诗歌的笺注方面有着突出的贡献。 古直对《重定陶渊明诗笺》一书做过三次修订，1926年出版的《陶靖节诗笺》书后《校勘记》一则。通过分析古直为陶诗所作的《校勘记...
- 张欢欢
- 关键词：古直诗歌创作
- 文献传递
- 飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控被引量：17
- 2014年
- 【目的】几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列(LmCHS2,GenBank登录号:GU067731)的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT—qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样本提取RNA,反转录成cDNA后,采用RT—qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后,观察中肠的形态变化及围食膜的完整性,探讨该基因在成虫期的生物学功能;饥饿处理飞蝗不同时间后,再重新进食,观察试虫肠道的变化,进一步运用RT—qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达,卵发育后期表达量急剧上升,在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达;分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2,与对照组相比,处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降,且取食量明显减少,雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%;解剖消化道后发现,注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物,中肠和胃盲囊长度显著缩短;对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整,而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失;饥饿处理飞蝗48 h后,与对照组相比,饥饿组中肠几乎不合有食物,长度亦显著缩短。H&E染色结果表明,饥饿组围食膜被严重破坏,对照组围食膜结构完整,与RNAi的结果非常相似;重新进食后围食膜发育良好;饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制,重新进食0.5 h后,其表达量快速上调,表明进食影响LmCH
- 刘晓健崔淼李大琪张欢欢杨美玲张建珍
- 关键词：飞蝗RNA干扰
