梁迎春
- 作品数：31 被引量：38H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市科技新星计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生自动化与计算机技术更多>>
- 利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白被引量：1
- 2015年
- 目的:克隆人N-ras蛋白全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人N-ras蛋白全长编码区基因,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,SDS-PAGE鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约600 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量约47×103的目的蛋白;纯化后,经鉴定获得了纯度较高的重组蛋白GST-N-Ras。结论:获得了重组蛋白GST-N-ras,为后续深入研究Ras基因与其他癌基因、抑癌基因的相互作用奠定了基础。
- 张云静冯滢滢徐小洁梁迎春张立王涛李玲郭靖纪贝贝张蓉叶棋浓
- 关键词：小G蛋白原核表达纯化
- 人ERK2基因对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响
- 2017年
- 目的:构建携带Myc标签的人细胞外信号调节激酶2(ERK2)的真核表达载体,表达Myc-ERK2融合蛋白,检测其对人视网膜母细胞瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从乳腺文库中扩增人ERK2基因序列,将其插入pXJ-40载体;将重组质粒与空载体转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞系后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果:双酶切和测序鉴定表明Myc-ERK2真核表达质粒构建成功;转染WERI-Rb-1细胞后融合蛋白获得表达,生长曲线实验结果表明ERK2可促进肿瘤细胞的生长。结论:携带Myc标签的人ERK2基因的真核表达载体能在人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞中表达,且能促进该细胞的生长。本实验为进一步研究ERK2在肿瘤尤其是眼恶性肿瘤中的功能奠定了基础。
- 韩笑刘莹梁迎春闫志风徐小洁梁九思洪甜尤文叶陈思禹黄俊叶棋浓刘丹
- 关键词：真核表达
- 人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定被引量：4
- 2015年
- 目的构建含His标签的自噬相关蛋白4同源物B(ATG4B)重组质粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出ATG4B基因的编码序列,插入p ET-28a(+)载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化Rossate菌,挑选小量诱导出的His-ATG4B菌液进行His-ATG4B蛋白的纯化,SDS-PAGE和Western blot法检测His-ATG4B蛋白的纯化效果,GST pull-down技术对蛋白生物学功能进行鉴定。结果用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到大小约1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)载体中构建出His-ATG4B重组质粒,酶切鉴定及测序结果均表明His-ATG4B质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化蛋白,得到相对分子质量(Mr)约为47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE检测蛋白纯化效果较好;GST pull-down实验证实His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在体外相互作用,生物学活性良好。结论本实验成功得到His-ATG4B蛋白,为研究ATG4B在自噬中的作用机制奠定实验基础。
- 黄蓉徐小洁梁迎春张立王涛周丽英杜楠叶棋浓
- 关键词：原核表达纯化自噬
- 一种小肽及其应用
- 本发明公开了一种肽及其应用。本发明提供的一种小肽，其氨基酸序列为<Image file="DDA0001185552760000011.GIF" he="57" imgContent="drawing" imgForma...
- 叶棋浓徐小洁李玲梁迎春范忠义
- 文献传递
- 人酪蛋白激酶1激酶区真核表达载体的构建及鉴定
- 2016年
- 目的:构建带Flag标签的酪蛋白激酶1α(CK1α)激酶区截短突变体CK1α(1-285aa)的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶区与已知相互作用蛋白Myc-Cdc25A之间的相互作用。方法:用PCR技术从人全长CK1α真核表达载体中扩增CK1α(1-285aa),将其克隆到Flag载体中,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达情况,免疫共沉淀分别检测Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A的相互作用。结果:双酶切和基因测序鉴定显示Flag-CK1α(1-285aa)真核表达载体克隆构建成功;Western印迹结果表明Flag-CK1α(1-285aa)转染人胚肾细胞293T细胞后获得表达;免疫共沉淀结果显示Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论:构建了Flag-CK1α(1-285aa)的真核表达载体,为进一步探讨Flag-CK1α激酶区对细胞信号通路的调节作用奠定了实验基础。
- 尤文叶褚春雨徐小洁梁迎春洪甜黄俊韩笑叶棋浓杨俊兰李瑛
- 关键词：真核表达CDC25A
- 人赖氨酸乙酰基转移酶7结构域蛋白的原核表达及纯化
- 2016年
- 目的:克隆人赖氨酸乙酰基转移酶7(KAT7)的2个功能结构域基因,获得其原核表达产物,并纯化蛋白。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人KAT7基因的2个功能结构域(1-330aa)和(331-611aa)编码片段,将其克隆到p ET28a载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中分别扩增获得约990和840 bp的DNA片段,并克隆至p ET28a载体,测序结果表明与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别约为42 000和36 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa)。结论:获得了重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa),为后续研究KAT7与肿瘤调控奠定了实验基础。
- 黄俊麦海星徐小洁梁迎春尤文叶李玲高风叶棋浓陈立军
- 关键词：原核表达纯化
- 携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定
- 2016年
- 目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要。
- 洪甜晋帅张立李玲梁迎春宋烨琼董倩刘阳徐小洁叶棋浓
- 关键词：真核表达LC3自噬
- myc-cyclin B1重组基因的克隆表达和细胞内定位
- 2014年
- 细胞周期蛋白B1（cyclin B1）是调控细胞由G2期向M期转换的重要因子之一, G2末期cyclin B1的表达达到高峰。激活细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2, CDK2）, 形成cyclin B1/CDK2复合物, 进入细胞核, 裂解一系列底物蛋白, 推动细胞从DNA合成期进入有丝分裂。肿瘤细胞的永生化与细胞周期的调控失常有密切关系, 并且发现, 作为一种细胞周期调节因子, cyclin B1与肿瘤有着非常密切的关系, 它是与肿瘤有直接关系的癌基因之一[1-2]。Cyclin B1[3]在许多癌细胞中均存在高表达[4-5], 如在卵巢癌、胃肠癌、宫颈癌和膀胱移行细胞癌中。在细胞周期G2/M起正性调控作用, 启动有丝分裂, cyclin B1高表达使细胞周期紊乱, 促进肿瘤的发生[6-7]。使用抗癌药可以降低cyclin B1表达, 细胞周期阻滞在G2/M期[8]。本实验拟构建cyclin B1的真核表达载体, 并验证其在细胞内的定位情况, 为进一步研究cyclin B1与肿瘤的关系奠定了实验基础。
- 周丽英冯滢滢徐小洁梁迎春王涛黄蓉李玲冀全博郑志兵叶棋浓
- 关键词：克隆真核表达
- 慢病毒介导的shRNA敲低FHL1的表达促进HeLa和HepG2细胞生长被引量：1
- 2015年
- 目的通过构建靶向四个半LIM结构域蛋白1（FHLl）基因的慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA），观察FHLl表达降低对HeLa细胞和HepG2细胞生长的影响。方法构建FHLl基因的shRNA干扰病毒载体，将重组质粒转染人胚肾293T细胞，实时定量PCR（qRT-PCR）和Western blot法检测转染pLenti-H1 FHLlsh RNA对FHLl表达的抑制效果。慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞和HepG2肝癌细胞，经2-3周嘌呤霉素筛选后得到FHLl稳定低表达的细胞，利用生长曲线实验和克隆形成实验检测FHLl基因表达降低后对细胞生长的影响，利用软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响。结果qRT-PCR和Western blot结果显示，构建的shRNA病毒载体能够明显抑制FHLl的表达；生长曲线实验和克隆形成实验显示，慢病毒介导的FHLlshRNA能够明显促进肿瘤细胞的生长；软琼脂实验结果表明，FHLl低表达能够促进肿瘤细胞的非锚定依赖性生长。结论构建的pLenti-H1 FHLl shRNA慢病毒载体可有效地抑制FHLl表达，明显促进HeLa细胞和HepG2细胞的增殖。
- 范忠义徐小洁张晓梅王涛韩白玉梁迎春叶棋浓焦顺昌
- 关键词：小发夹RNA细胞生长
- RNA干扰介导Bcl-2下调促进ZR75-1和MCF-7乳腺癌细胞凋亡
- 2015年
- 目的构建高效稳定的Bcl-2基因的RNA干扰慢病毒载体,检测Bcl-2的表达对细胞凋亡的影响。方法构建人Bcl-2慢病毒短发夹RNA(shRNA)干扰载体Lenti-H1 shRNA,转染HEK293T细胞,通过实时定量PCR及Western blot法检测Lenti-H1 shRNA的干扰效果。Lenti-H1 shRNA与4个包装质粒共同转染HEK293T细胞,包装成慢病毒后,分别感染ZR75-1和MCF-7乳腺癌细胞;嘌呤霉素筛选2周,收集细胞进行Western blot法检测Bcl-2蛋白的水平;采用流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡情况。结果构建的Lenti-H1 Bcl-2 shRNA能够有效抑制Bcl-2蛋白的表达;流式细胞术结果显示,Bcl-2表达下调后明显促进细胞凋亡。结论慢病毒介导的Bcl-2蛋白下调能促进乳腺癌细胞的凋亡。
- 史平安徐小洁纪贝贝梁迎春李玲杜楠叶棋浓吕朝晖
- 关键词：BCL-2蛋白RNA干扰慢病毒细胞凋亡
