段文元
- 作品数：24 被引量：47H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院野战输血研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金海外青年学者合作研究基金上海市浦江人才计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 融合蛋白ICOSIg的三维结构模建的研究被引量：1
- 2005年
- 目的:利用结构相似性的序列比对来模建ICOSIg的三维结构,分析其可能的结合位点,为 改造ICOSIg的突变体,提高其结合活性提供理论基础。方法:利用生物信息学手段分析ICOS所 属CD28家族各成员分子的结构域,通过基于结构相似的序列比对,以空间结构已经得到解析的 CTLA4为模板,利用同源模建的方法,模建ICOS膜外区的空间结构。进一步地以人IgG2和 CTLA4为模板,模建了ICOSIg全长的空间结构。在此基础上,结合氨基酸特性,分析其可能的功 能位点。结果:FDPPPF及KTKGSGN基序可能是ICOSIg的功能结合位点。结论:模建了ICOSIg 的空间结构,分析了其可能结合位点,为突变ICOSIg提高其亲和力提供了线索。
- 许雪青王丰白云王璞段文元姜曼黎万玲
- 关键词：融合蛋白CTLA4结合活性CD28同源模建功能位点
- cDNA疫苗预防寄生虫感染的优势与缺陷被引量：8
- 2003年
- 近年来DNA疫苗技术的快速发展 ,为研制能有效激活机体的体液免疫和细胞免疫机制的多价疫苗提供了良好的前景。cDNA疫苗的出现为一些重要的寄生虫病 ,如疟疾、利什曼病、弓形虫病、血吸虫病、片形吸虫病的预防提供了可能性。然而接种疫苗的效果更多取决于疫苗的接种方式、剂量、接种途径、疫苗接种宿主的种甚至是株。为了解决上述问题 ,还需要作进一步的研究工作 ,尤其是后续新的cDNA序列的克隆及检测 ,基因组计划 ,疫苗的不同接种方法 。
- 段文元张锡林
- 关键词：寄生虫感染安全性接种方法
- 基于CFSE染色的小鼠淋巴细胞体内示踪方法的建立被引量：3
- 2011年
- 目的确定CFSE标记小鼠淋巴细胞的条件,建立简单快速、稳定可行的淋巴细胞体内示踪方法。方法利用流式细胞术分别检测不同浓度CFSE、不同悬浮溶液(1640培养基、PBS溶液)对小鼠淋巴细胞标记效果的影响,确定合适的标记条件;输注同品系CFSE标记的小鼠淋巴细胞,于不同时间点检测受鼠主要脏器内CFSE+细胞在淋巴细胞中的比例,并确定供鼠细胞的注射剂量;按照合适的注射剂量分别在注射后不同时间点测定供鼠细胞在受鼠体内的分布,考察本方法的稳定性及阳性信号的持续时间。结果 PBS组CFSE+细胞平均荧光强度分别为596、793、1123、1596、1737,明显高于1640培养基组(P<0.05);1640培养基组CFSE+细胞死亡率分别为8.7%、8.4%、8.6%、9.0%(P>0.05),而PBS组CFSE+细胞死亡率随着CFSE终浓度的上升而增加(P<0.05);按照不同剂量输注同品系淋巴细胞24h后,在受鼠各组织中检测到CFSE+细胞;每只小鼠尾静脉注射5×106个CFSE+淋巴细胞后,到d63仍可在组织中检测到阳性信号细胞。结论以PBS作为孵育液、CFSE终浓度选择10μmol/L对小鼠淋巴细胞标记、注射剂量为细胞5×106个/只,可使CFSE+细胞信号在同系小鼠体内持续2个月。
- 汤永永唐颖张玉华段文元赵敬湘魏广智张秀媛李鹏飞穆思媛王字玲
- 关键词：CFSE淋巴细胞流式细胞术细胞标记
- 人PD1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定被引量：8
- 2005年
- 目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1(+)片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1(+)表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。
- 段文元白云张华欣姜曼黎万玲
- 关键词：基因工程真核表达
- 斯氏肺吸虫半胱氨酸蛋白酶的原核表达及其免疫活性分析
- 2003年
- 目的 对克隆的斯氏肺吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA进行原核表达并检测其免疫反应性。方法 利用PinPointTM Xa 1T表达载体系统 ,对已克隆的斯氏肺吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段在大肠杆菌中进行原核表达。通过SDS PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物 ,分别检测所表达融合蛋白的分子量和免疫反应性。结果 SDS PAGE结果显示 ,与对照相比较目的克隆在 3 3× 10 3处有一明显差异带。Westernblot结果则表明有一阳性条带出现 ,分子量为 3 3×10 3。结论 通过原核表达获得斯氏肺吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA的表达融合蛋白 ,分子量为 3 3× 10 3;
- 王英张锡林张艳玲段建华段文元
- 关键词：斯氏肺吸虫半胱氨酸蛋白酶原核表达
- 淋巴细胞输注体内示踪方法研究
- 目的确定小鼠淋巴细胞CFSE标记条件、输注剂量及体内分布研究的方法。方法利用流式细胞术分别检测1640培养基与PBS溶液作为孵育液对不同浓度CFSE标记小鼠淋巴细胞的效率、荧光强度、标记后细胞存活的影响,确定合适的孵育液...
- 汤永永段文元赵敬湘魏广智王宇玲
- 斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因pET22b载体的构建及表达被引量：2
- 2005年
- 目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b(+)表达载体,利用SDSPAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性。方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA,经RTPCR扩增及T/A克隆后测定其核苷酸序列并进行序列查询与比对。根据已获得的序列和pET22b(+)载体的内切酶位点信息设计引物并再次进行T/A克隆,阳性克隆质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段与pET22b(+)载体连接并转化至BL21(DE3)菌株,收集经IPTG诱导表达后的菌液进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果SDSPAGE显示,经诱导表达的阳性克隆菌株、未经诱导菌株与空载体菌株之间的蛋白带型未见明显差异,但经诱导表达的阳性克隆菌株的22ku蛋白条带比另两菌株明显,免疫印迹证实,该蛋白条带可与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生强阳性反应。结论成功构建了含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因的pET22b(+)载体,经诱导表达的融合蛋白能与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生较强的免疫反应。
- 邱宗文张锡林王英段文元
- 关键词：斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶
- 鼠B7-H4基因重组腺病毒的构建及其在B16F10细胞中的表达、鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的构建表达鼠B7-H4的重组腺病毒并检测其在B16F10细胞中的表达。方法采用RT-PCR技术,取小鼠肺脏,TriPure提取肺脏总RNA,反转录得到cDNA序列,PCR扩增B7-H4全长,克隆到plenti6/V5克隆载体中并经过测序证实与标准序列一致。加入适当的酶切位点,双酶切PCR扩增产物连接入pAd track CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAd track CMVmB7-H4,经酶切线性化后,用CaCl2的方法转化到含有腺病毒骨架质粒pAd Easy的BJ 5183大肠杆菌中,挑选同源重组菌落提取质粒,酶切线性化重组质粒并转染293细胞,包装成重组病毒颗粒。重组病毒上清感染B16F10细胞,并用PE标记的B7-H4单克隆抗体检测B16F10细胞mB7-H4蛋白的表达。结果RT-PCR扩增得到含编码mB7-H4的860 bp基因片段,与预期大小一致,并经过测序证实与标准序列一致。成功构建了mB7-H4重组腺病毒,病毒滴度达到3×1013pfu/ml,pAd mB7-H4重组腺病毒表达载体感染B16F10细胞后,荧光显微镜观察显示PE标记的mB7-H4单克隆抗体染色B16F10细胞阳性。结论成功构建了mB7-H4重组腺病毒,转染B16F10细胞后表达出有活性的B7-H4蛋白,为进一步研究B7-H4分子在器官移植、自身免疫性疾病以及肿瘤逃逸机制中的作用奠定了基础。
- 段文元白云罗娜许雪青
- 关键词：B7-H4基因工程同源重组
- 斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆和表达被引量：1
- 2003年
- 目的 克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并进行原核表达。方法 利用简并引物 ,进行RT -PCR ,扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入 pUCm -T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。将获得的cDNA片段克隆入Pin PointTMXa- 1T表达载体 ,经过筛选后 ,在大肠杆菌中进行原核表达。通过SDS -PAGE电泳和Westernblot方法鉴定表达产物 ,并检测所表达融合蛋白的免疫反应性。结果 RT -PCR扩增出了一 5 0 0bp左右的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 98bp。推导出的氨基酸序列长 16 6 ;氨基酸序列的同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺残基高度保守。原核表达中 ,对表达产物的鉴定结果和免疫反应性检测结果均显示 ,目的克隆在 33kDa处有一明显条带。结论 本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,其序列中包含了与该酶活性有关的重要位点。原核表达获得一 33kDa的融合蛋白 ,该融合蛋白具有免疫反应性。
- 王英张锡林段文元张艳玲段建华
- 关键词：斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶基因表达基因克隆
- 淋巴细胞输注体内示踪方法研究
- 2010年
- 汤永永段文元赵敬湘魏广智王字玲
- 关键词：细胞输注示踪CFSE小鼠淋巴细胞荧光强度
