祝怀平
- 作品数：19 被引量：38H指数：3
- 供职机构：苏州大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 抗vWF与GPIb-IX结合部位的噬菌体呈现型单链抗体制备及功能研究
- 2005年
- 目的:为了研制新型特异性抗血栓制剂。方法:利用噬菌体展示文库技术筛选与vWF- A1区有高亲合力单链抗体(ScFv) ;基因重组的方法构建高效表达载体pET 2 0b(+) ScFv ,在大肠杆菌中诱导表达;夹心ELISA方法鉴定此单抗的抗原结合活性;瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集试验(RIPA)测定ScFv对血小板聚集的抑制作用。结果:噬菌体展示技术筛选的ScFv在大肠杆菌中成功地诱导表达,表达的ScFv占菌体总蛋白的4 1% ,以包涵体形式存在;经纯化复性的ScFv可以与vWF、rvWF- A1、rvWF- A1 A3结合,但不与rvWF A3、BSA反应;ScFv具有抑制RIPA功能,抑制率为73. 7%。结论:在大肠杆菌中高效表达的噬菌体展示技术筛选的抗vWF A1区ScFv可特异性与vWF- A1区结合,而抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集,显示出很好的应用前景,为研制新型抗栓药物奠定基础。
- 祝怀平王迎春季顺东江淼白霞阮长耿
- 关键词：VWF
- 血小板胶原受体糖蛋白Ⅵ体外表达
- 2005年
- 目的利用基因重组技术体外表达血小板糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)胞外区片段。方法采用PCR方法扩增GPⅥ胞外区片段cDNA,构建表达载体pET-20b(+)-GPⅥ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTAResin纯化后复性;使用Westernblot方法鉴定重组蛋白性质。结果PCR扩增产物经测序证明与GPVI胞外区cDNA序列完全一致;酶切分析证明成功构建了表达载体pET-20b(+)-GPⅥ;原核细胞经诱导表达后出现新的相对分子量为32kd的蛋白条带,诱导产物以包涵体形式存在;Western印迹分析表明重组蛋白可与抗Penta-His抗体和抗GPⅥ多抗特异性结合。结论正确构建了GPⅥ表达载体并成功表达重组蛋白,纯化、复性后的重组蛋白具有良好的抗原性。
- 余自强董宁征白霞祝怀平季顺东江淼阮长耿
- 关键词：血小板胶原
- 抗vWF与GPIb-IX结合部位的单链抗体制备及功能研究
- 血栓性疾病严重威胁着人类健康的常见疾病之一,血栓形成是其主要成因。血小板的粘附、聚集和活化是血栓形成的早期环节,在此过程中von Willebrand因子(vWF)发挥着重要作用,它通过A1、A3区分别与血小板膜糖蛋白(...
- 祝怀平王迎春季顺东江淼白霞阮长耿
- 文献传递
- 人vW因子A3区基因在大肠杆菌中表达及其生物学活性的研究被引量：3
- 2004年
- 血管性血友病因子 (vWF)是介导血小板粘附到细胞外基质的桥梁 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 ,可通过阻断vWF与细胞外基质的结合而阻断血小板的粘附。本研究目的是研究一种抗血栓形成的新疗法。应用RT PCR方法从人脐带内皮细胞中克隆vWFA3区基因并在大肠杆菌中表达 ;应用胶原结合试验及竞争抑制实验分析rvWF A3蛋白的生物学活性。结果表明 :表达的重组蛋白量占菌体总蛋白的 4 6 % ,包涵体经过变性、纯化和复性 ,获得重组蛋白 (rvWF A3) ;rvWF A3具有很好的胶原结合活性 ,且能竞争性抑制野生型vWF与胶原结合。结论 :大肠杆菌中高效表达的rvWF A3具有良好的生物学功能 ,可作为阻断剂用于干预vWF介导的血小板黏附过程 。
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- 关键词：VWF胶原
- 人vWF-A1多肽的融合表达及生物学活性鉴定
- 2003年
- 血管性血友病因子 (vWF)通过与血小板膜糖蛋白结合介导血小板的粘附和聚集 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 .通过阻断血小板与vWF的结合可抑制血栓形成 .应用RT PCR方法从人脐带内皮细胞中克隆vWF A1区基因并在原核细胞内进行表达 ,经过纯化、复性 ,获得重组蛋白(rvWF A1) .用流式细胞术检测rvWF A1与转染了糖蛋白Ib(GPⅠb)的CHO K1细胞和血小板GPⅠb的结合能力 ,血小板聚集仪测定rvWF A1对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集作用的影响 .重组表达载体pET 2 0b(+ ) vWF A1在大肠杆菌BL2 1(DE3)plus中得到有效表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 30 % .次氮基三乙酸镍琼脂糖 (Ni NTAagarose)柱纯化后 ,其纯度为 95 % .经复性的rvWF A1蛋白具有良好的生物学活性 ,它可与转染了GPⅠb的CHO K1细胞和血小板结合 ,阳性率分别为 96 90 %与 78 6 0 % ,且可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集 ,其抑制效应呈剂量依赖性 .IC50 的rvWF A1浓度为 0 5 6 μmol L ,当浓度为 1 4 μmol L时抑制率最高达 84 70 % .结果表明 ,在原核细胞中表达人rvWF A1区蛋白可抑制血浆中野生型vWF与血小板的结合 。
- 祝怀平王迎春赵小娟季顺东白霞阮长耿
- 关键词：生物学活性血管性血友病因子
- 人vW因子A3区基因的克隆及其序列分析被引量：1
- 2003年
- 目的 克隆人血管性血友病因子（von Willeberand Factor,vWF)A3区基因并进行序列分析。方法 应用Trizol一步法从原代培养的人脐静脉内皮细胞中抽提总RNA，应用RT-PCR扩增vWFA3区基因。并与pUCmT载体连接构建成重组克隆载体pUCmT-vWF-A3，全自动测序仪测量目的基因DNA序列。结果 RT-PCR从内皮细胞中扩增出约600bp的DNA片段，酶切鉴定插入目的基因片段的大小与理论计算一致。重组克隆载体pUCmT-vWF-A3经测序其结果完全正确。结论 本法可成功地克隆入vWFA3区基因片段，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 祝怀平王迎春等
- 关键词：VWF血栓血小板
- 人-鼠嵌合抗血小板单抗SZ-2 Fab片段基因的构建和表达研究被引量：1
- 2003年
- 目的:降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性,为其进一步研究、应用奠定基础。方法:用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA,应用RT-PCR技术,扩增出SZ-2重链、轻链可变区基因,克隆人载体pUCm-T,测序分析。应用基因重组技术,将SZ-2轻、重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和κ轻链恒区基因进行拼接,构建人-鼠嵌合Fab片段基 因表达质粒pSW1-2 Fab/Hu,并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达。以ELISA、Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验,对表达产物进行检测、验证。结果:克隆的基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因的特征;表达质粒pSW1-2Fab/Hu拼接正确;在大肠肝菌中的表达量约为180μg/L;表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集。结论:成功地克隆了SZ-2可变区基因;并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。
- 祝怀平江淼戴克胜阮长耿
- 关键词：嵌合抗体可变区基因血小板
- 血管性血友病因子基因SmaI多态性与动脉血栓性疾病的关系被引量：2
- 2001年
- 戴克胜高维强祝怀平王迎春白霞阮长耿
- 关键词：血管性血友病因子基因多态性SMAI动脉血栓性疾病
- 人von Willebrand因子A1区基因的克隆和表达被引量：2
- 2002年
- 为了深入研究血栓形成的机制以及开发新的抗血栓药物 ,将人vonWillebrand(vWF)因子A1区cDNA在大肠杆菌中表达 ,以获得高效表达的具有生物学活性的重组A1区蛋白 ,应用PCR方法从含有人全长vWFcDNA质粒中扩增A1区基因片段 ,并将其克隆至pUCm T载体中 ,经DNA序列分析后 ,将其重组于有 6×HisTag的融合蛋白表达载体pQE 31中 ,并在大肠杆菌M1 5中诱导表达。采用Ni NTA柱进行纯化 ,用Western印迹鉴定。结果表明 ,PCR扩增得到 854bp的A1区基因片段 ,序列测定结果与文献报道一致。IPTG诱导 5小时后表达的vWF因子A1蛋白占菌体总蛋白的 30 %左右 ,经Ni NTA纯化后其纯度在 95 %以上。Western印迹检测显示A1蛋白具有很好的抗原性和特异性。结论 :成功地在大肠杆菌中高效表达了人vWFA1区蛋白 。
- 祝怀平王迎春季顺东白霞阮长耿
- 关键词：基因克隆基因表达血友病VONWILLEBRAND因子
- 人von Willebrand因子A1和A3功能结构域嵌合体的表达及生物学功能被引量：1
- 2004年
- vWF介导血小板粘附到细胞外基质 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 ,可通过阻断vWF与细胞外基质的结合阻止血小板的粘附 .应用RT PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆vWF分子A1、A3区基因并在大肠杆菌中表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 12 6 % ,包涵体经过变性剂溶解、纯化和复性 ,获得重组蛋白 (rvWF A1 A3) .应用流式细胞术检测rvWF A1 A3与血小板膜糖蛋白 (GPⅠb)的结合功能 ;血小板聚集实验观察rvWF A1 A3对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集 (RIPA)的影响 ;ELISA胶原结合实验及竞争抑制实验分析rvWF A1 A3与胶原的结合活性 .结果显示 :rvWF A1 A3嵌合体与血小板的结合阳性率为 70 4 % .rvWF A1 A3嵌合体不能引起血小板的聚集 ,但rvWF A1 A3嵌合体与血小板温育后可以阻断ristocetin诱导人血浆vWF对血小板的聚集作用 ,而且呈剂量依赖性 ,IC50 的rvWF A1 A3浓度为 0 76 μmol L ,当浓度为 1 17μmol L时抑制率最高达 76 8% .rvWF A1 A3具有良好的胶原结合活性 ,同时它可以竞争性抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合 ,抑制率为 76 % .表明rvWF A1 A3可作为阻断剂用于干预vWF介导的血小板粘附过程 ,同时又可以阻断血浆vWF与血小板GPIb结合抑制血小板聚集 ,具有良好的抗栓应用前景 .
- 祝怀平王迎春季顺东江淼白霞阮长耿
- 关键词：VWF生物学功能
