韩玉霞
- 作品数：9 被引量：21H指数：3
- 供职机构：石河子大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国际科技合作与交流专项项目新疆生产建设兵团博士基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 布鲁氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋养层细胞中的作用分析被引量：5
- 2014年
- 目的筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒性检测;建立布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞模型,构建布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;采用酵母双杂交技术筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白,实时定量PCR检测靶蛋白表达量的变化。结果成功构建了pGBKT7-virB4诱饵质粒,转入Y187后无毒性,不能自激活;获得了布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;筛选到了13个阳性质粒,其中蛋白辅酶Q10和SLC3A2在布鲁氏菌侵染后mRNA表达量均增加。结论本试验对VirB4蛋白与宿主细胞的互作研究为进一步阐明布鲁氏菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。
- 孙志华刘良波张豫刘娟韩玉霞刘来珍郭乾陈创夫张辉
- 关键词：布鲁氏菌CDNA文库酵母双杂交MRNA
- 不同生物型BVDV感染对MDBK细胞类泛素基因转录水平的影响被引量：5
- 2015年
- 探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛胚肾细胞(MDBK)类泛素基因转录水平的影响。对致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株及非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株进行增殖,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应测定2种病毒拷贝数,按照Reed-Muench法测定BVDV NADL病毒TCID50值。以100TCID50BVDV NADL病毒和同等拷贝数的BVDV shz 132病毒分别感染MDBK细胞不同时间(4、12、24、48h)后收集细胞,提取细胞总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用特异性引物,通过RT-qPCR反应检测细胞类泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9的转录水平。结果显示,致细胞病变型BVDV NADL感染MDBK细胞48h,引起细胞显著的病变,而非致细胞病变型BVDV shz 132感染不引起细胞病变。BVDV NADL和shz 132的病毒拷贝数分别是1.13×1011 copies/mL和1.77×1011 copies/mL,BVDV NADL的TCID50是10-4.9 TCID50/0.1mL。RT-qPCR分析显示,与对照组相比,2种BVDV病毒感染都能引起MDBK细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相对表达量变化。在BVDV shz 132感染的细胞中,SUMO1、SUMO2、SUMO3的相对表达量在各个感染时间都高于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,以上3个基因的相对表达量下调,差异极显著(P<0.01);而Ubc9基因的相对表达量则低于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,其相对表达量上调,差异极显著(P<0.01)。结果表明,BVDV感染调控了MDBK细胞SUMO系统,提示细胞SUMO系统参与了BVDV在胞内的活动,且这种调控作用与病毒的生物型存在密切联系。
- 韩玉霞孟露萍孙志华刘娟张辉陈创夫
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒
- 天山北坡放牧绵羊面部湿疹的临床病理学研究被引量：3
- 2013年
- 本研究为探讨放牧绵羊面部湿疹的发病机理，对天山北坡天然草场放牧绵羊面部湿疹的临床发病过程，病理解剖与组织学，血清肝功能指标进行了调查和测定；并对100只发病羊和100只健康羊及5只病死羔羊进行了真菌的分离培养和真菌类型统计学分析。结果显示，绵羊发病只在特定区域草场发病，以6月龄内细毛羊多发，以面部（耳，眼睑）及颌下炎性水肿为特征，病死羔羊肝肿大，表面有黄白色斑状坏死灶，切面有结节性硬变及纤维化，肝组织学显示肝淤血，肝细胞和胆管严重坏死，脂肪变性。发病羊血清中的谷氨酰转肽酶（GGT）活性为94．93～260．78U·L-1，明显高于健康羊16．47～61．59u·L-1谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）也明显高于健康绵羊（P〈0．01），而发病羊和健康羊的谷草转氨酶（AsT）活性差异不显著（P〉0．05）；发现205只试验羊都有真菌的感染，发病羊的分离菌中纸皮思霉属、链格孢菌属、镰刀菌属和曲霉属真菌4种菌的分离率较其他属真菌高，其中纸皮思霉属分离率为最高，酵母菌、根霉属和毛霉属真菌在发病羊和健康羊都有分离，但是分离率都较低。表明本地区放牧绵羊湿疹属肝功能不全和肝坏死引发的肝原性光过敏性湿疹，其病原可能为纸皮思霉属、链格孢菌属、镰刀菌属和曲霉属4种真菌。
- 刘良波韩玉霞孙焕林柳建新杨祎王建华卜万喜齐亚银剡根强
- 关键词：绵羊面部湿疹临床病理学谷氨酰转肽酶
- 布鲁菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达被引量：1
- 2014年
- 以羊种布鲁菌043株基因组为模板,利用PCR扩增二氢硫辛酰胺脱氢酶(BMEI0145)基因,连接pMD18-T载体后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-28a载体中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果显示,成功克隆了BMEI0145基因,片段大小为1 404bp;SDS-PAGE显示,BMEI0145蛋白分子质量约为62ku;Western blot分析显示,BMEI0145蛋白可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应。表明成功获得了BMEI 0145蛋白,该蛋白具有与布鲁菌自身蛋白相同的抗原性,为进一步研究布鲁菌基因工程疫苗和布鲁菌病的诊断奠定了基础。
- 关团张辉王震孙志华刘娟韩玉霞王文华江雅丽陈创夫
- 关键词：布鲁菌克隆原核表达
- 金黄色葡萄球菌ClfA基因缺失株的生物学特性被引量：2
- 2015年
- 采用检测金黄色葡萄球菌Clf A缺失株在固、液体培养基中生长规律发现Clf A缺失株的生长繁殖力弱于强毒株;药敏试验结果表明Clf A缺失株和强毒株在对苯唑西林和新霉素的敏感性上有变化,缺失株对苯唑西林和新霉素更为敏感;通过小鼠腹腔、后腿注射细菌,观察小鼠生理状态变化,表明后腿注射缺失株的小鼠行走正常,触摸有肿胀结块,剖后肌肉有出血点,注射强毒株的小鼠有拖地行走现象,肌肉细胞发生溶解消失,注射Clf A缺失株对小鼠毒力弱于强毒株;建立细菌感染乳腺模型并制作组织切片观察组织病变,结果显示乳腺注射Clf A缺失株的母鼠乳腺有化脓灶,有的中性粒细胞坏死崩解,注射野毒株的小鼠乳腺与周围组织发生粘连,乳腺间质增宽,血管扩张充血,部分乳腺泡发生了溶解脱落;抗体水平检测中,Clf A缺失株攻毒后血清中IgG含量低于强毒株和对照组。结果表明,Clf A基因在细菌生长和致病中起了重要作用,金黄色葡萄球菌Clf A基因缺失株在生长繁殖力和致病力上比强毒株446株明显减弱。
- 刘娟孙志华张华雷许长萌韩玉霞李明奇张辉
- 关键词：金黄色葡萄球菌毒力
- 牛布鲁菌侵染对HPT-8细胞p38基因转录水平的影响被引量：2
- 2015年
- 探讨布鲁菌侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)过程中对p38基因转录的影响。用牛布鲁菌2308和RB51株分别侵染HPT-8细胞,在不同侵染时间点(0、4、8、12、48h)收集细胞,提取总RNA,反转录获得cDNA;构建p38α、p38β和内参基因GAPDH的克隆质粒,并绘制3种基因扩增的标准曲线;RT-qPCR检测p38α和p38β基因的转录表达。结果显示,获得了HPT-8细胞侵染前后的cDNA,构建了pMD18-T-p38α/p38β/GAPDH克隆质粒,绘制了标准曲线。RT-qPCR结果显示,布鲁菌2308和RB51侵染滋养层细胞后(4、8、12、48h),p38α和p38β的相对表达量比0h均明显下降,差异极显著(P<0.01),布鲁菌RB51株和2308株也存在一定差异。结果表明,在布鲁菌侵染HPT-8细胞的过程中,p38 MAPK信号通路被下调,提示p38 MAPK信号通路参与了对细胞生物学效应的调控,且这种调控作用与菌株的毒力强弱存在密切联系。
- 韩玉霞王震张倩孙志华刘娟张辉陈创夫
- 关键词：P38MAPK信号通路布鲁菌
- 布氏杆菌Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA的克隆、原核表达及免疫原性分析被引量：2
- 2015年
- 为克隆并原核表达布氏杆菌(Brucella melitensis)疫苗菌株M5Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA,并进行表达蛋白的免疫原性分析,应用PCR技术从布氏杆菌疫苗菌株M5全基因组扩增RicA基因片段,亚克隆至pMD18-T载体后测序分析,构建重组表达载体pET-28a(+)-RicA,转化E.coli BL21(DE3)表达菌,以不同浓度IPTG诱导表达不同时间,SDS-PAGE鉴定表达效果,表达蛋白经AKTA蛋白纯化系统纯化,用Antheprot 5.0软件分析其理化特性及抗原性,Western Blot检测其免疫原性。结果表明:RicA基因全长528bp,编码175个氨基酸,与基因库中已知菌株的核苷酸同源性和氨基酸同源性均达到99%以上。SDS-PAGE表明,RicA融合蛋白在大约23ku处出现条带,纯化后条带单一。软件分析发现RicA蛋白融合抗原性较强,Western Blot检测证明其有较好的免疫原性。说明,成功克隆并表达布氏杆菌疫苗菌株M5 RicA基因,为进一步研究其与布氏杆菌Ⅳ型分泌系统及布氏杆菌致病机制之间的关系奠定了基础。
- 韩玉霞孙志华刘娟关团张辉陈创夫
- 关键词：布氏杆菌
- FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用
- 2014年
- 为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。
- 孙志华杜军伟刘娟许长萌韩玉霞关团陈创夫张辉
- 关键词：布鲁氏菌巨噬细胞凋亡
- 布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275基因的原核表达与鉴定被引量：1
- 2016年
- 【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-28a,构建表达重组质粒pET-28a-BPE123和pET-28aBPE275,在大肠杆菌中进行诱导表达,Western blot分析重组蛋白His-BPE123和His-BPE275的免疫学特性。【结果】PCR扩增获得了462bp的BPE123基因片段和762bp的BPE275基因片段,成功构建了pET-28a-BPE123、pET-28a-BPE275原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BPE123和BPE275蛋白,经SDS-PAGE检测,重组融合蛋白BPE123、BPE275的分子质量分别约为22和31ku,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别表达的蛋白。【结论】克隆了分泌蛋白BPE123、BPE275基因片段,并成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275。
- 孙志华张辉刘来珍刘娟韩玉霞关团王浩陈创夫
- 关键词：布鲁氏菌
