目的:骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一。实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体,为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础。方法:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成。①实验材料:含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠;双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司),Zeo(Invivogen公司);pTA2?-T Easy(鼎国生物技术有限公司)。②实验过程及评估:以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定。结果:①聚合酶链反应获得长度约1216bp的目的片段,与预期片段相符。②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配。结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体。
