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基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达被引量：3: 2012年; 目的通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1～404 aa)及其跨膜疏水区(351～378 aa)缺失突变体E2(1～350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响。方法利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列。结合重叠延伸PCR(OE-PCR)原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况。结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1～404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒pET21b-E2(1～404)和pET21b-E2(1～350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1～350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1～404)有明显提高。结论 E2蛋白跨膜疏水区(351～378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高。; 章萍萍潘卫曹洁陈秋莉王锦红张华群葛宜兵祁培培刘超邓松华; 关键词：缺失突变体原核表达

人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用: 本发明涉及生物医药工程技术领域。HIV-1型转录反式激活因子(trans-activator of transcription，Tat)是HIV-1感染早期产生的重要调控蛋白。本发明的目的在于筛选到分子构象相对稳定且能引...; 曹洁潘卫张华群陈秋莉王锦红廖文婷葛宜兵祁培培刘超章萍萍杨界何婷

SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选被引量：1: 2015年; 目的使用人免疫球蛋白G(IgG)对金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)单结构域突变体组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同突变体组合的特异结合优势,探索优势组合分子结构与功能间的关系。方法通过Overlap PCR获得SPA中A和C单结构域突变体片段组合构成的噬菌体文库,再使用人IgG对文库进行体外亲和筛选,期望通过对特定结合分子的定向改造及体外进化获得具有高结合优势的组合分子。结果成功构建符合体外筛选要求的SPA单结构域A在29、30位氨基酸定点突变文库(A1)、SPA单结构域C在36、37位定点突变文库(C1)和SPA单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽(AI37)、SPA单结构域C在20位后插入3个随机连接肽(CI20),将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1,将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37CI20。两个文库各自经过4、5轮亲和筛选,文库进化完全。Phage-ELISA高光密度值的单克隆,测序结果分析为A(Q29K30)A(I29I30)和AI-TQSA。结论通过定向改造技术获得了高结合能力的定点突变分子A(Q29K30)A(I29I30)和插入突变分子AI37-TQSA,为Ig结合分子的定向改造及具有新的Ig结合特性的重组Ig结合分子的进一步研究奠定了基础。; 林子玉丁莹莹周鹏高彩霞冯娇娇王锦红潘卫邓松华

噬菌体展示HIV-1 Tat38-61碱性区51和55位随机突变体文库的构建被引量：4: 2011年; 为了构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库,进一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子进化筛选,采用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法获得51和55位氨基酸随机突变的全长Tat编码序列,再以此为模板PCR扩增出两端含有Xba I识别序列的Tat38-61突变体片段HIV-1 Tat38-61(51N/55N),克隆至噬菌体展示载体pCANTAB5S上,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库。结果显示文库的库容量为5.0×106,滴度为2.65×1012 TU/mL,阳性克隆率为56.50%;序列分析显示文库中51、55位核苷酸与氨基酸均呈随机性分布,达到了对文库进行分子进化筛选的要求,为获得可用作疫苗候选物的新型Tat突变体奠定基础。; 葛宜兵杨旭芳杜哲明庞强曹洁陈秋莉王锦红张华群廖文婷祁培培刘超章萍萍邓松华潘卫; 关键词：HIV-1 TAT 随机突变噬菌体展示

具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子: 本发明公开了具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子及其制备方法和应用。本发明还公开了该人IgA结合分子的编码基因、基于噬菌体分子进化的人IgA结合分子的制备方法及其应用。本发明公开的人IgA结合分子，尤其是人I...; 潘卫曹洁温宗梅陈秋莉蒋少华王锦红戚中田; 文献传递

人IgG四亚类对噬菌体展示Ig结合蛋白单结构域随机组合文库的体外进化筛选被引量：3: 2012年; 金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SpA)和链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SpG)是细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多个序列高度同源的结合结构域重复组成的抗体结合区,各单结构域都具有完全的结合IgG的功能。为研究这些单结构域随机组合能否产生具有新结合特性的组合分子,将SpA的A、B、C、D、E以及SpG的B2、B3共7个单结合结构域随机组合构建成噬菌体展示文库后,应用人IgG1、2、3、4为诱饵分子对该文库进行4轮筛选,获得了SpA天然分子中不存在的单结构域排列组合分子D-C。在筛选过程中,阴性对照噬菌体的逐渐减少、展示两个结构域以上的噬菌体比例不断增多,尤其是D-C组合的选择性富集和其随机连接肽的严格筛选都显示了筛选的有效性和D-C组合的重要性。噬菌体ELISA进一步证实D-C与人IgG四亚类的结合能力远强于天然SpA分子。该研究应用分子进化技术首次获得了一种与人IgG四亚类具有结合优势的新型组合分子D-C,不仅可为IgG纯化、制备、检测等方面的应用提供新的候选分子,还为细菌IBP结构功能的进一步研究提供新的手段。; 祁培培丁莹莹吴莉莉陈秋莉王锦红刘超廖文婷张婧曹洁潘卫; 关键词：噬菌体 IGG 亚类

HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达: 2009年; 目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。; 李存枚潘卫曹洁王锦红黄德圣庞强廖文婷邓松华; 关键词：TAT

一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用: 本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用。本发明提供的一种人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体，是缺失疏水区的Tat△(31-45)突变体，其氨基酸序列如S...; 曹洁杨界潘卫张华群王锦红廖文婷祁培培陈秋莉丁超何婷丁莹莹; 文献传递

不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库的体外进化研究被引量：1: 2014年; 目的判断不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点,采用不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行亲和筛选。方法不同亚类小鼠IgG对噬菌体文库进行亲和筛选,获得具有结合优势的单结构域排列组合,噬菌体ELISA法来比较其与不同亚类小鼠IgG的结合特性,优势组合分子经原核表达蛋白,HRP标记后,ELISA法进一步来比较其与小鼠不同亚类IgG的结合特性。结果小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3分别经过5、4、5和5轮亲和筛选后,其文库的展示片段大小均为2个domain,表明进化完全。测序分析显示:小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3筛选得到的具有结合优势组合分子分别是D-D、D-D、A-C和D-C。噬菌体ELISA验证结合优势组合分子对小鼠不同亚类IgG的结合能力;蛋白经HRP标记后的ELISA结果和筛选不完全一致,但其结合强弱具有一致性,均为:IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。结论得到3种不存在于天然SpA、SpG分子中,分别与不同亚类小鼠IgG具有较强结合作用的新型组合分子D-D、A-C和D-C,为进一步研究IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。; 徐文竹丁莹莹吴莉莉张婧冯娇娇王锦红潘卫邓松华; 关键词：噬菌体文库定向进化亚类

人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白N末端缺失突变体融合蛋白的表达及其免疫原性分析被引量：1: 2011年; 本研究采用PCR方法从人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)HXB2株tat基因中扩增编码Tat蛋白N末端1-21位氨基酸缺失的突变体Tat22-101基因片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat22-101,经双酶切及测序验证后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达及Ni^(2+)-NTA柱亲和层析纯化。纯化后的突变体融合蛋白PET32a-Tat22-101经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,其相对分子质量约为26.9kD。该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测结果表明,pET32a-Tat22-101融合蛋白不仅较好地保留其免疫原性,而且能诱导产生高滴度的针对Tat N末端区之外的Tat其他功能区表位的抗体,为进一步研究Tat生物学功能和研制新型HIV Tat疫苗奠定试验基础。; 张华群廖文婷陈秋莉葛宜兵杨界章萍萍祁培培刘超何婷王锦红潘卫曹洁; 关键词：人类免疫缺陷病毒1型 TAT蛋白缺失突变免疫原性

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王锦红

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