蔡剑锋
- 作品数：9 被引量：9H指数：2
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- 人支气管上皮细胞聚-ADP-核糖水解酶缺陷细胞株的构建及鉴定被引量：5
- 2012年
- 目的建立高效、稳定的人支气管上皮细胞(16HBE)的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷细胞株,为研究PARG在环境毒物诱导细胞损伤中的作用及了解聚-ADP-核糖基化反应的功能奠定基础。方法设计并合成能编码特异靶向人PARG基因的短发夹RNA(shRNA)的oligo DNA,将之插入到真核表达载体plko.1-puro中构建重组质粒,鉴定成功后转染至正常的16HBE细胞中,RT-PCR及western blot检测完成筛选细胞株的PARG基因及蛋白水平的表达,并使用流式细胞仪分析构建成功细胞株的生长周期变化。结果重组质粒测序鉴定正确;RT-PCR及western blot检测显示最终选定的缺陷细胞株干扰效率达80%以上,效果显著(与正常细胞相比,P<0.05);且缺陷细胞株的生长周期未见明显变化(P>0.05)。结论该研究成功构建了高效、稳定的人支气管上皮细胞的PARG缺陷细胞株,为阐明ADP-核糖基化反应的作用机制及其生物学效应提供了可靠的平台。
- 蔡剑锋黄海燕刘建军杨淋清吴德生夏菠毛吉炎胡恭华刘庆成李习艺庄志雄
- 关键词：慢病毒载体
- 人支气管上皮细胞聚-ADP-核糖水解酶缺陷细胞株的构建及鉴定
- 目的：建立高效、稳定的人支气管上皮细胞(16HBE)的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷细胞株,为研究PARG在环境毒物诱导细胞损伤中的作用及了解聚-ADP-核糖基化反应的功能奠定基础.方法：设计并合成能编码特异靶向...
- 黄海燕蔡剑锋刘建军杨淋清吴德生夏菠刘庆成庄志雄
- 关键词：支气管上皮细胞慢病毒载体
- 聚-ADP-核糖基化在六价铬致人支气管上皮细胞损伤中的作用
- 1.研究背景 鞣革、印染、电子、炼矿等工业行业广泛应用铬的化合物，这些化合物中及生产后形成的六价铬[Cr(Ⅵ)]以“三废”形式大量排放至自然环境。Cr(Ⅵ)化合物是人体极毒物，具有生殖、遗传等多器官、多方面的毒性，被国...
- 蔡剑锋
- 关键词：六价铬
- 苯并[a]芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法的建立
- 2015年
- 目的建立苯并[a]芘(B[a]P)作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法。方法使用免疫共沉淀技术收集可能发生ADP-核糖基化修饰的蛋白,同步使用高效液相色谱技术和双向电泳技术对蛋白进行分离,再进行MALDI-TOF-MS/MS鉴定,比较两种分离方法鉴定蛋白的差异,并将鉴定蛋白的氨基酸序列与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白的保守序列进行比对。结果通过高效液相色谱分离结合质谱鉴定找出3个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定找出12个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定方法存在明显优势;所鉴定蛋白存在与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白相似的保守序列。结论免疫共沉淀蛋白双向电泳分离结合质谱鉴定方法可用于分析ADP-核糖基化修饰蛋白,并发现ADP-核糖基化蛋白存在相对保守的结合序列。
- 高玮黄海燕蔡剑锋李绚刘银品刘建军庄志雄陈雯
- 关键词：苯并[A]芘免疫共沉淀高效液相色谱双向电泳
- 苯并芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法的建立
- 目的：建立苯并芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法。方法：本研究使用免疫共沉淀技术收集可能发生ADP-核糖基化修饰的蛋白，同步使用高效液相色谱技术和双向电泳对蛋白进行分离，再对分离的样品进行MALDI-TOF-MS/...
- 黄海燕蔡剑锋高玮李绚刘银品刘建军徐新云庄志雄
- 关键词：免疫共沉淀高效液相色谱
- 聚-ADP-核糖基化在六价铬诱导人支气管上皮细胞基因组DNA甲基化水平改变中的作用被引量：3
- 2014年
- 目的 研究聚-ADP-核糖基化与DNA甲基化在六价铬[Cr（Ⅵ）]致癌过程中的作用,并对两者之间的联系进行探讨.方法 选用前期建立的聚-ADP-核糖水解酶（PARG）缺陷的人支气管上皮细胞（16HBE细胞）作为研究对象,使用Cr（Ⅵ）分别对正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞进行处理,通过甲基化免疫荧光技术分析两种不同细胞基因组DNA整体甲基化水平变化,同时检测整体甲基转移酶活性的变化,并进一步利用RT-PCR和western-blotting分别从mRNA和蛋白水平上分析DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2）的表达变化.结果 正常16HBE细胞Cr（Ⅵ）处理24h后,基因组DNA甲基化水平降低,且具有剂量-效应关系,而PARG缺陷细胞此种表现不明显；当Cr（Ⅵ）的作用剂量为5.0 μmol/L时,16HBE细胞和PARG缺陷细胞内总体DNA甲基转移酶活性分别为49.33±2.65、80.05±2.05,较对照组（分别为99.27±1.10、99.30±0.60）下降了50％和20％.正常16HBE细胞Cr（Ⅵ）处理24 h后,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2的mRNA和蛋白水平表达均呈下降趋势.PARG缺陷细胞中DNMT1和DNMT3a的表达出现下调,0、0.3、1.2、5.0 μmol/LCr（Ⅵ）处理组胞内DNMT1 mRNA的相对表达量分别为0.99 ±0.04、0.79±0.05、0.65±0.08、0.51±0.10（F =544.13,P＜0.01）,蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、0.69±0.15、0.65 ±0.10、0.55±0.13（F=214.12,P＜0.01）；DNMT3a mRNA的相对表达量分别为1.00±0.04、0.93±0.11、0.79±0.07、0.59±0.05（F =498.16,P＜0.01）,蛋白相对表达量分别为1.00 ±0.14、0.97 ±0.11、0.79±0.17、0.57 ±0.15（F =390.11,P＜0.01）；但DNMT3b和MBD2表达改变不明显.结论 聚-ADP-核糖基化可通过调节DNMT3b和MBD2的活性,对抗Cr（Ⅵ）诱导的广泛基因组低甲基化,维持细胞基因组整体甲基化水平的稳定.
- 黄海燕蔡剑锋胡恭华夏菠杨淋清刘建军黄新凤吴德生庄志雄
- 关键词：铬DNA甲基化人支气管上皮细胞
- PARG基因沉默在六价铬诱导细胞周期改变中的作用被引量：2
- 2016年
- 目的深入了解PARG的功能及探讨PARG基因沉默在调节六价铬诱导细胞周期改变的作用。方法使用前期构建的PARG基因缺陷细胞(sh PARG细胞)和正常16HBE细胞作为研究对象,进行0、0.3、0.6、1.2、2.5和5.0μmol/L的六价铬[Cr(Ⅵ)]溶液染毒处理24 h,利用免疫荧光法检测PAR的表达、流式细胞仪观察细胞周期、RTPCR分析ATM和P53基因mRNA水平的表达。结果 Cr(Ⅵ)染毒处理后,正常16HBE细胞的S期明显延长,0、0.3、0.6、1.2、2.5和5.0μmol/L剂量组S期细胞比例分别为18.3%、21.6%、26.0%、30.9%、38.8%和43.2%,G2期明显缩短;sh PARG细胞的S期延长,但比例增幅远小于正常16HBE细胞,0、0.3、0.6、1.2、2.5和5.0μmol/L剂量组S期细胞比例分别为17.0%、19.0%、20.1%、21.2%、24.5%和31.3%。正常16HBE细胞内P53基因表达随Cr(Ⅵ)作用剂量的增加而逐渐升高,PARG缺陷细胞内P53基因表达改变不明显(与对照组相比,P>0.05);Cr(Ⅵ)染毒处理后,两种细胞内ATM基因的表达均增加,但正常16HBE细胞内增加更明显,如:5.0μmol/L的Cr(Ⅵ)作用时,正常16HBE细胞内ATM基因的表达升高可达6.67倍(与对照组相比,P<0.01),而sh PARG细胞内ATM基因表达仅升高2.27倍(与对照组相比,P<0.01)。结论 PARG基因沉默可对抗Cr(Ⅵ)诱导的细胞周期时相改变。
- 黄海燕蔡剑锋刘建军夏菠杨淋清吴德生黄新凤杨细飞洪文旭庄志雄
- 关键词：16HBE细胞
- 人支气管上皮细胞聚-ADP-核糖水解酶缺陷细胞株的构建及鉴定
- 目的建立高效、稳定的人支气管上皮细胞（16HBE）的聚-ADP-核糖水解酶（PARG）缺陷细胞株,为研究PARG在环境毒物诱导细胞损伤中的作用及了解聚-ADP-核糖基化反应的功能奠定基础。方法设计并合成能编码特异靶向人P...
- 黄海燕蔡剑锋刘建军杨淋清吴德生夏菠刘庆成庄志雄
- 关键词：慢病毒载体
- 聚-ADP-核糖基化在六价铬致细胞损害中的作用机制探讨
- 2014年
- 目的 探讨聚-ADP-核糖基化在Cr（Ⅵ）致细胞损害中的作用.方法 选用前期建立的聚-ADP-核糖水解酶（PARG）缺陷的人支气管上皮细胞（16HBE细胞）作为研究对象,选用不同剂量的Cr（Ⅵ）分别染毒,并处理正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞24 h,同时设立溶剂对照组,比较两种细胞对Cr（Ⅵ）毒作用的差异;在此基础上,选取5.0 μmol/L的Cr（Ⅵ）作为染毒剂量,染毒处理两种细胞后,提取细胞总蛋白进行双向荧光差异凝胶电泳（2 D-DIGE）分析,计算比较两种细胞染毒前、后的总蛋白表达差异,对差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）鉴定,并进一步使用Western blot验证.结果 Cr（Ⅵ）作用后,PARG缺陷细胞的存活较正常16HBE细胞多,当作用剂量达到5.0 μmoL/L时,16HBE细胞和PARG缺陷细胞的存活率分别为（59.67±6.43）％和（82.00±6.25）％,两者之间的差异有统计学意义（t=-4.32,P＜0.05）;2D-DIGE分析比较正常16HBE细胞与PARG缺陷细胞Cr（Ⅵ）染毒前、后蛋白差异,共筛选且成功鉴定出18个蛋白,这些蛋白的功能涉及维持细胞形态、参与能量代谢、DNA损伤修复以及基因表达调控.Western blot成功验证出差异表达蛋白cofilin-1,其在染毒后的16HBE细胞中表达上调,相对表达量为1.41 ±0.04,对照组表达量为1.00±0.01,差异有统计学意义（t=-18.00,P＜0.05）.在PARG缺陷细胞表达差异无统计学意义（t=-8.61,P＞0.05）.结论 鉴定出的差异蛋白大多与肿瘤发生密切相关,推测聚-ADP-核糖基化反应可通过抑制Cr（Ⅵ）诱导的肿瘤发生从而对抗Cr（Ⅵ）的细胞毒性,这为阐明聚-ADP-核糖基化在Cr（Ⅵ）致细胞损害中的作用机制提供了重要的参考依据.
- 李绚蔡剑锋庄志雄刘建军夏菠胡恭华李习艺黄海燕
- 关键词：铬细胞人支气管上皮细胞
