雷蕾
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 供职机构：天津医科大学基础医学院更多>>
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- ERT2-Cre诱导的Rosa26R-YFP报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率检测
- 2014年
- 目的 探索ERT2-Cre诱导的黄色荧光蛋白（YFP）报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率.方法 通过基因型分型的方法,从Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠杂交得到的后代中,筛选出YFP及ERT2-Cre双阳性转基因杂交小鼠;采用免疫磁珠法从双阳性转基因小鼠骨髓细胞中富集c-kit＋造血干祖细胞群进行体外培养,并用不同浓度4-羟基它莫西芬（OHT）作用不同时间以诱导YFP表达;流式细胞术检测c-kit＋造血干祖细胞中YFP的表达量.结果 Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠的杂交后代共9只,采用基因型分型方法筛选出双阳性转基因小鼠5只;体外培养的c-kit＋细胞部分形态发生变化,提示存在细胞分化;流式细胞术检测到c-kit＋细胞中YFP表达量可达13.7％.结论 YFP报告基因系统在OHT诱导的ERT2-Cre作用下,能有效标记小鼠造血干祖细胞.
- 罗琦尹洁孟歆怿杨冰雷蕾孙琰李丹丹王瑾王玺何景华
- 关键词：造血系统造血干祖细胞
- 采用CRISPR knockin技术实现VEGF165定点敲入HEK293T细胞系的构建
- 2019年
- 目的构建定点敲入血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的人肾上皮细胞系HEK293T,避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应。方法根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体(pUCm-T-VEGF165质粒)和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒],再将这两个质粒共转染HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况,蛋白质印迹法(Western Blot)检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况。结果实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示,与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组比较,共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高(VEGF165 mRNA:3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18,均P<0.01;VEGF165蛋白:3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05,均P<0.01),EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低(EZH2 mRNA:0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16,均P<0.01;EZH2蛋白:0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06,均P<0.01)。该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中,并干扰了EZH2的表达。结论采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系。
- 郭再玉张合亮陈谦侯延伟水涛武莉莉刘艺洁费乔曼黄欢雷蕾孙琰孔雨赵秀娟韩雅婷杨冰张玲
- 关键词：血管内皮生长因子165
