旨在证明miR-324-3p可以通过调控其预测的靶基因MC1R及其下游基因的表达从而对羊驼皮肤黑色素的合成产生影响。本研究在体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中转染miR-324-3p过表达载体,应用qRT-PCR与Western blotting分析比较各试验组中MC1R基因与毛色相关基因小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associtated transcription factor,Mitf)、酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)、酪氨酸相关蛋白2(Tyrosinase related protein 2,Tyrp2)的表达差异性,利用酶标仪检测黑色素产量的变化。结果显示:(1)miR-324-3p在棕色与白色羊驼皮肤中均有表达,且在棕色羊驼皮肤中极显著表达(P<0.01),其相对表达量是白色的1.64倍;(2)黑色素细胞被转染了miR-324-3p过表达载体后,处理组靶基因MC1R及其下游调控基因Mitf、Tyr和Tyrp2的表达量与黑色素产量较空白对照组均有下调,且以Mitf基因表达量极显著下调(P<0.01)。综上表明,羊驼皮肤中miR-324-3p可能通过调控MC1R基因的表达,顺势下调MC1R基因下游调控基因Mitf、Tyr与Tyrp2的表达,最终对羊驼皮肤黑色素细胞中黑色素的类型及合成量产生影响。
为探究绵羊骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的生物学特性,本试验综合运用NCBI、DNAMAN、DNAStar、TMHMM Server v.2.0、PsortⅡ、SignalP等多种生物信息学软件推测绵羊BMP4基因序列性质及编码蛋白的理化性质、疏水性、磷酸化位点、保守性结构域和二级结构,并用SWISS-MODEL Workspace预测三维结构。结果显示,绵羊BMP4基因与各物种的BMP4基因存在很高的同源性,编码蛋白是一个不稳定的亲水蛋白,不存在跨膜区,很可能位于细胞核中,且存在信号肽。BMP4具有18个磷酸化位点,通过功能域的预测发现,含有2个功能域,即TGF-β超家族和TGF-β前肽超家族。这与BMP4基因家族的功能相一致,证明了绵羊BMP4是一种生长因子,具有信号传导功能。蛋白三维结构预测结果与模板3bmp.1.A同源性达到了88.29%。绵羊BMP4基因的生物信息学分析可为以后实践中深入研究其功能提供参考。
