王露露
- 作品数：10 被引量：17H指数：2
- 供职机构：第三军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市科技创新能力建设计划项目国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 敲低小鼠内源性CYP3A酶的shRNA分子、重组表达载体及其制备方法和应用
- 本发明公开了敲低小鼠内源性CYP3A酶的shRNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，还公开了含有该shRNA分子的重组表达载体pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA以及该载体的制备方法，还公开了该sh...
- 王勇魏泓庞浩周晓杨王露露刘昌峨刘勤
- 文献传递
- 重组慢病毒滴度的检测方法
- 本发明公开了慢病毒载体的滴度检测方法，具体为运用流式细胞分选法检测对照病毒滴度，将待测病毒与对照病毒在相同条件下同时感染相同数量的靶细胞，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的靶细胞的总DNA，通过相对定量PCR检测获得待测...
- 魏泓王勇刘宇郭科男刘昌峨江雯周晓杨刘勤王露露
- 人sCD40L转基因小鼠模型的构建
- 2012年
- 目的研究阻断CD40-CD40L共刺激信号通路对移植皮肤免疫排斥反应的影响。方法通过RT-PCR技术克隆了呈可溶性表达的CD40L分子胞外区(sCD40L),利用K14启动子构建了sCD40L皮肤特异性表达载体,并利用该载体制备了转基因小鼠。结果所克隆的CD40L胞外区片段其大小及序列符合预期;以哺乳动物表达载体PCI为骨架,通过DNA重组,获得了含K14启动子和sCD40L编码区的皮肤特异性表达载体K14-sCD40L;通过显微注射和胚胎移植,PCR筛选检测:49只G0代小鼠有1只小鼠扩增出特异性条带,阴性对照无条带。结论成功建立sCD40L转基因阳性小鼠。
- 艾必燕樵星芳周晓杨王露露杨扬陈建康刘勤
- 关键词：转基因小鼠SCD40L
- 重组慢病毒滴度的检测方法
- 本发明公开了慢病毒载体的滴度检测方法，具体为运用流式细胞分选法检测对照病毒滴度，将待测病毒与对照病毒在相同条件下同时感染相同数量的靶细胞，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的靶细胞的总DNA，通过相对定量PCR检测获得待测...
- 魏泓王勇刘宇郭科男刘昌峨江雯周晓杨刘勤王露露
- 文献传递
- 人Waardenburg综合征点突变SOX10 p.R106W小鼠模型的构建及听力表型初步研究
- 2023年
- 目的制备人Waardenburg综合征点突变SOX10 p.R106W小鼠模型,比较分析该突变在小鼠、小型猪及人中诱发的听觉功能表型的异同。方法通过比对人、猪和小鼠的SOX10编码蛋白的氨基酸序列,找到与人SOX10 p.R106W突变所对应的小鼠Sox10基因同源位点,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑引入突变,构建Sox10 c.316A>T(Sox10 p.R106W)点突变小鼠。采用听觉脑干反应测试、耳蜗组织切片等方法评估突变小鼠听力表型。对耳蜗组织进行mRNA转录组测序,对差异表达基因进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析,借助String数据库分析差异表达基因与Sox10之间的关联性。结果获得了携带有Sox10 c.316A>T突变的基因编辑小鼠,该突变小鼠表现为腹部白斑,杂合稳定遗传。与野生型小鼠比较,Sox10 c.316A>T杂合突变小鼠对声波刺激的敏感性及内耳形态结构均没有明显的差异。转录组分析发现突变小鼠耳蜗中323个基因表达上调,283个基因表达下调,但大部分基因表达差异较小。对差异表达基因GO富集分析发现上调基因与免疫相关,下调基因与神经功能有关。利用String数据库分析显示,表达下调的基因中有5个与Sox10基因有关联,分别是神经丝重多肽(neurofilament heavy polypeptide,Nefh)、脂肪酸2-羟化酶(fatty acid 2-hydroxylase,Fa2h)、缝隙连接蛋白B1(gap junction protein beta 1,Gjb1)、神经生长因子受体(nerve growth factor receptor,Ngfr)、锌指蛋白536(zinc finger protein 536,Zfp536),均与内耳发育或功能无关。结论应用CRISPR/Cas9系统成功构建Sox10 p.R106W基因编辑小鼠,其听力表型无显著改变,与该突变在人和小型猪中诱发的疾病表型差异较大。
- 王露露谢飞赵清远徐凯刘传宏贺秋月郭科男孙宇王勇
- 关键词：WAARDENBURG综合征小鼠模型
- FQ-PCR在转基因产品检测中的应用研究进展被引量：7
- 2008年
- 实时荧光定量PCR(real-time fuorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是近年来定量PCR技术中兴起的最新定量检测技术,因其具有灵敏性高、特异性强、结果精确、反应快速、安全可靠等优点,现已广泛应用于医学和生命科学的各个研究领域,论文就实时荧光PCR技术的主要原理、分类方法以及在转基因产品检测中的应用等进行简要综述。
- 宋勇涛王勇刘勤王露露刘昌峨魏泓
- 关键词：实时荧光定量PCR转基因产品
- 慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立被引量：8
- 2008年
- 目的以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法慢病毒包装采用三质粒系统。3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G。病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒。将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度。用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下。在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达。将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平。结果病毒液浓缩前的滴度≥106TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109TU/ml以上。将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1189/1453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132h观察胚胎,均发现有较强荧光。在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率>90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎。胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1453)。将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29)。结论通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠。我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系。
- 刘勤张晋宇王露露刘昌峨王勇万瑛
- 关键词：慢病毒载体增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠
- 慢病毒介导的CYP3A11基因knock-down小鼠的建立被引量：1
- 2010年
- 目的构建和筛选小鼠P4503A11基因miR RNAi慢病毒载体,建立CYP3A11基因knock-down小鼠。方法利用Ravi Sachidanandam's Lab的在线软件设计沉默小鼠P4503A11基因的miRNA所对应的shRNA序列,PCR扩增后克隆到PCI-GFP-MiR质粒中,其再与慢病毒载体FUW进行重组。将psPAX2和pMD2.G两个载体和FUW-GFP-MiR-shRNA重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒。用包装好的病毒液感染293FT细胞后,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定。将上述重组慢病毒载体分别转染FVB/N小鼠肝细胞,转染48h后,检测P4503A11基因mRNA表达水平的变化。选取干扰效果最好的FUW-GFP-MiR-shRNA1重组慢病毒载体进行制备基因knock-down小鼠模型。用显微注射法将浓缩的shRNA1病毒液注射至FVB/N小鼠12细胞期胚胎透明带下。将注射后发育至22细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。在紫外光照射下利用滤光片观察GFP在小鼠活体内的表达水平。结果DNA测序结果显示3个重组慢病毒载体均与所设计的shRNA序列一致。检测的3个浓缩前慢病毒悬液的滴度均≥106TU/ml,经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109TU/ml以上。转染FUW-GFP-MiR-shRNA1、2的2组肝细胞的P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组均显著下降(P<0.05),而转染阴性对照FUW-GFP-MiR-shRNA-NC的肝细胞P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组无明显改变。选用FUW-GFP-MiR-shRNA1慢病毒载体制备的F0代3A11基因knock-down小鼠,在紫外光照射下,阳性小鼠可见较强的荧光。结论构建并筛选出小鼠P4503A11基因有效的靶向miR RNAi慢病毒载体,并成功建立CYP3A11基因knock-down小鼠。
- 庞浩刘昌峨刘勤王露露郭科男王勇魏泓
- 关键词：细胞色素P-450CYP3AKNOCK-DOWN微RNAS慢病毒小鼠
- 慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立被引量：1
- 2012年
- 目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型。
- 王露露刘勤周晓杨刘昌峨王勇魏泓
- 关键词：HLA-G慢病毒转基因小鼠
- 整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用及方法
- 本发明涉及基因重组领域，特别涉及整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达中的介导剂中的应用，本发明与向胚胎胞质或胞核注射mRNA相比，本发明显著延长ZFN于动物早期胚胎的表达时间；体外检测表明，mRNA注射法表...
- 魏泓王勇刘宇郭科男刘昌峨江雯周晓杨刘勤王露露
- 文献传递
