吴帆
- 作品数：13 被引量：37H指数：4
- 供职机构：中国计量大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学经济管理环境科学与工程更多>>
- 烟粉虱MED隐种气味结合蛋白OBP8的克隆、原核表达及与植物挥发物的结合特性被引量：7
- 2016年
- 烟粉虱为重要的入侵性经济作物害虫,对入侵地寄主植物存在选择性和偏好性。为明确烟粉虱气味结合蛋白(odorant binding protein,OBPs)的相关特性,通过克隆其OBP8基因Btab OBP8,进行同源基因进化关系分析,构建原核表达载体诱导表达重组蛋白,并利用基于荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)的荧光竞争结合试验测试了Btab OBP8与不同寄主植物挥发物的结合功能。结果表明,Btab OBP8基因的开放阅读框全长480 bp,编码159个氨基酸,与半翅目其它害虫的OBP8基因进化关系较远。Btab OBP8蛋白重组后,4种化合物即β-紫罗兰酮、月桂烯、柠檬烯和P-伞花烃将1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,其中β-紫罗兰酮和月桂烯与Btab OBP8的结合能力最强,解离常数分别为13.32μmol/L和21.53μmol/L。表明β-紫罗兰酮和月桂烯与Btab OBP8具有良好的亲和力,推测Btab OBP8对β-紫罗兰酮和月桂烯的识别可能参与了烟粉虱对绿色开花植物的吸引和选择作用。
- 王然张晓曼李峰奇吴帆李红亮罗晨
- 关键词：烟粉虱基因克隆原核表达
- 光谱分析Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与β-紫罗兰酮的相互作用被引量：4
- 2016年
- 为明确烟粉虱在入侵过程中的寄主选择性与其化学感受系统对寄主植物挥发物的分子识别之间的相互作用和化学机理,通过荧光、紫外光谱和圆二色谱等技术分析了烟粉虱化学感受蛋白Bt CSP1与一种重要的植物挥发物成分—β-紫罗兰酮之间的相互作用。结果表明,β-紫罗兰酮与Bt CSP1在不同温度时的猝灭机理不同,300 K(27℃)时二者的亲和力较弱,表观结合常数KA为2.44×105L/mol,较低温290 K(17℃)和高温310 K(37℃)时的3.22×105L/mol和3.23×105L/mol均要低,表明Bt CSP1与β-紫罗兰酮在不同的温度下呈现不同的结合机理,低温时为静态猝灭,而高温时为动态猝灭。通过热力学参数和非辐射能量转移理论分析,β-紫罗兰酮与Bt CSP1蛋白结合时发生了荧光共振能量转移,结合距离为5.2 nm。圆二色谱结果显示,随着β-紫罗兰酮浓度的升高,Bt CSP1蛋白中α-螺旋比例逐渐减少,由纯蛋白时的63%下降到55.9%,二级结构发生了变化。
- 张萌吴帆王然冯一璐罗晨李红亮
- 关键词：烟粉虱化学感受蛋白Β-紫罗兰酮荧光光谱
- Q型烟粉虱气味结合蛋白OBP8的克隆、原核表达及与植物挥发物的结合特性
- 烟粉虱为重要的经济作物害虫之一,其寄主植物虽然广泛,但存在不同的偏好性,目前对于这种特性的分子机理研究较少.气味结合蛋白OBP 是昆虫与外界化学信息交流的重要蛋白.为明确烟粉虱气味结合蛋白的相关特性,本研究根据转录组数据...
- 张晓曼吴帆王然李红亮罗晨
- 关键词：烟粉虱原核表达
- Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征被引量：9
- 2015年
- 【目的】克隆Q型烟粉虱(Bemisia tabaci)化学感受蛋白1(chemosensory protein 1,CSP1)基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白(以下简称Bt CSP1),研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,连接并构建p ET-30a(+)原核表达载体,转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,并用IPTG诱导表达Bt CSP1重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞,离心取上清,经Ni2+-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后,经PBS反复透析获得重组蛋白,并用Bradford法测定重组蛋白浓度。采用常见的N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)荧光探针作为报告子,利用荧光竞争结合法研究重组Bt CSP1蛋白与植物挥发物的结合功能。首先用1 mmol·L-1 1-NPN滴定Bt CSP1蛋白溶液,直至蛋白最大发射波长处的荧光值完全猝灭为止,然后再以各供试配基滴定Bt CSP1-1-NPN体系,通过配基竞争猝灭1-NPN最大发射波长,并用Scatchard等方程计算表征Bt CSP1与配基亲和力大小的解离常数KD。【结果】克隆了Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,经双酶切和连接构建了p ET-30a(+)/CSP1重组质粒,在IPTG终浓度为1 mmol·L-1的条件下诱导获得了Bt CSP1重组蛋白,Ni2+-琼脂糖柱纯化透析后测定重组蛋白浓度,稀释至1.5μmol·L-1作为工作浓度。在荧光光谱试验中,Scatchard方程线性化后(相关系数达到0.9967),显示Bt CSP1与1-NPN的解离常数K1-NPN为2.78μmol·L-1,结合位点数n为0.82,表明两者结合较好,且基本是1:1结合,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子。在荧光竞争结合试验中,有多种供试植物挥发物分子能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,其中包括能引起烟粉虱趋避行为的化合物,如3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和α-蒎烯(KD值分别为26.47、39.43、54.01和83.46μmol·L-1),且3-蒈烯具有较强的竞争结合能力,能在200μmol·
- 吴帆张晓曼赵磊崔旭红李红亮罗晨
- 关键词：烟粉虱化学感受蛋白原核表达植物挥发物
- 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位被引量：2
- 2017年
- 【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位,明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至p ET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中,挑取单克隆菌落接种于LB培养基,培养过夜后按1%(V/V)进行转接,继续培养至OD600≈0.4左右时,加入IPTG至终浓度为1 mmol·L^(-1)后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清,再加入细菌裂解液超声破碎,离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化,再经PBS透析液透析后,最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm,测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用,用Scatchard方程计算其解离常数,再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbra A6晶体结构(PDB代码:1n8v)为模板,通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式,根据Mol Dock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析,获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况,以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体,并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片,然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位,以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白,利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K1-NPN为2.1μmol·L^(-1),结合位点数n为0.99,表明结合时基本以1:1结合,线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中,CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸(9-ODA),和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力,其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC50]和解离常数KD分别达到10.1和7.68μmol·L^(-1)。分子�
- 谭静宋欣密傅晓斌唐明珠吴帆华启云李红亮
- 关键词：中华蜜蜂化学感受蛋白分子对接免疫细胞化学定位
- 茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2的基因克隆、原核表达及其结合功能被引量：9
- 2017年
- 【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)进行全长cDNA序列克隆(Gen Bank登录号为KX421383)后,将该基因与pET32a载体连接构建表达载体。随后向导入pET32a/EoblPBP2表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中对其表达载体加入终浓度1 mmol·L^(-1)的IPTG进行蛋白的诱导表达,进一步利用镍NTA琼脂糖凝胶柱和含有咪唑的上清缓冲液分离目的蛋白,以PBS缓冲液作为透析液纯化得到高浓度重组蛋白。最后通过荧光竞争法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子以放大荧光信号,随后向重组蛋白与1-NPN混合体系中分别加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10种测试气味后经过分子荧光光度计扫描得到相对荧光值,计算各配基的解离常数KD,研究重组蛋白与茶尺蠖性信息素和茶树挥发物的生理功能。【结果】EoblPBP2全长为492 bp,编码了163个氨基酸,蛋白相对分子质量为15.9kD,等电点为4.983,具有保守的6个半胱氨酸,根据分子进化树分析其应归属于昆虫PBPs家族。结合功能结果显示,10种测试气味均能将1-NPN与茶尺蠖EoblPBP2重组蛋白的混合体系于420 nm处的相对荧光值降至50%以下。其中β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5种茶树挥发物质与EoblPBP2重组蛋白的结合能力较强,解离常数KD分别为7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L^(-1)。
- 冯一璐傅晓斌吴帆崔宏春李红亮
- 关键词：茶尺蠖信息素结合蛋白原核表达
- 中华蜜蜂气味结合蛋白配基结合特征和OBP12与吡虫啉结合机理研究
- 中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius（简称中蜂）是中国特有的蜜蜂品种，与意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica（简称意蜂）相比，它有利用零星蜜源植物、采集力强以及抗螨抗病能...
- 吴帆
- 关键词：中华蜜蜂气味结合蛋白吡虫啉
- 文献传递
- 一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法
- 本发明公开了一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，属于生物技术领域。方法包括，步骤1：根据枇杷18S RNA的ITS序列，设计并获得了特异寡核苷酸引物和TaqMan探针；步骤2：利用改进的CTA...
- 李红亮张籍吴帆
- 中华蜜蜂Ac-CSP3与新烟碱类农药的相互作用
- [背景]新烟碱类杀虫剂(neonicotinoid insecticides)是上世纪80年代发展起来的一种全新结构的超高效杀虫剂,由于它具有高效、广谱、药效持续时间长、对人兽低毒等优点,在我国农业生产环节中被广泛使用,...
- 宋欣密谭静吴帆李红亮
- 关键词：中华蜜蜂吡虫啉啶虫脒
- 一种基于信息素结合蛋白的茶尺蠖性信息素的筛选和鉴定方法
- 一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素筛选和鉴定方法，属于生物工程技术领域。其包括：收集茶尺蠖雄蛾触角总RNA；通过RT‑PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长；构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导茶尺...
- 李红亮冯一璐赵磊吴帆傅晓斌
- 文献传递
