于磊
- 作品数：2 被引量：19H指数：1
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划卫生行业科研专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1(Irs1)基因被引量：18
- 2014年
- 目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。
- 马元武马婧路迎冬陈炜张旭于磊张连峰
- 关键词：基因敲除CRISPR
- 利用dCas9-FokⅠ编辑大鼠Dnmt1基因被引量：1
- 2016年
- CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型Fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合,形成融合蛋白用于降低脱靶效应。FokⅠ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶,在本研究中,通过将FokⅠ功能结构融合到dCas9的N端,构建表达质粒p ST1374-dCas9-FokⅠ。我们前期研究中,发现一个sgRNA在介导Cas9编辑Dnmt1基因建立条件敲除大鼠时,存在显著的脱靶现象。以此为基础,我们利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系统编辑大鼠Dnmt1基因,研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-FokⅠmRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中,用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植,最终获得43只F0代大鼠,其中两只在靶点位置包含突变,突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析,结果显示,无脱靶现象存在。综上,表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因,并能显著提高特异性。尽管dCas9-FokⅠ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统,基因编辑效率有所下降,但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。
- 张旭于磊陈炜高珊潘硕张连峰马元武
- 关键词：DNMT1
