任建峰
- 作品数：27 被引量：36H指数：4
- 供职机构：上海海洋大学水产与生命学院水产种质资源发掘与利用省部共建教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：教育部留学回国人员科研启动基金上海市科委国际合作基金上海市教育委员会创新基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生历史地理更多>>
- 斑马鱼DEAD-box家族的分子结构特征及进化分析被引量：3
- 2020年
- DEAD-box RNA解旋酶家族(Asp-Glu-Ala-Asp box RNA helicase family)高度保守,在RNA代谢中发挥十分重要的作用。该家族成员众多且与发育、免疫、肿瘤发生等密切相关。本研究利用生物信息学方法鉴定了15个物种中DEAD-box家族的成员,结果显示该家族在低等生物到高等生物中均存在,在无脊椎动物中成员数目有30个左右,进化程度升高,成员数目也随之增加,脊椎动物中成员数目稳定存在40个左右。深入分析斑马鱼中DEAD-box家族各成员的蛋白结构、理化性质和亚细胞定位,结果显示该家族蛋白序列包含15个保守基序,除ddx47和ddx58外,均含有D-E-A-D保守氨基酸序列,且在染色体上分布广泛。蛋白相对分子量较大,除Ddx41和Ddx47外,均大于40 kD。该家族有7个为稳定性蛋白,33个均为不稳定性蛋白,且除Ddx41外,均表现疏水性质,蛋白亚细胞定位显示主要在细胞核,其次是细胞质和线粒体,并在细胞质膜、胞外基质、内质网、高尔基体和过氧化物酶体中有少量分布。根据聚类分析可知斑马鱼DEAD-box家族与人和小鼠中各成员之间具有良好的对应关系,且不同成员之间进化关系很近,ddx5和ddx17、eif4a和eif4a3以及ddx6和ddx61支持率均为100%。本研究不仅全面比较了该家族的进化关系,还系统分析了斑马鱼DEAD-box家族成员的信息,为深入认识该家族成员以及利用斑马鱼研究该家族的功能提供了一定的理论依据。
- 时灿包林珠任建峰李伟明张庆华
- 关键词：结构域系统进化
- 斑马鱼myd88和traf6真核表达载体的构建被引量：2
- 2021年
- 髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88, MYD88)和TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)均属于Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)家族成员中的关键衔接分子。斑马鱼是研究先天免疫应答的独特模式生物,为了构建myD88和traf6的真核表达载体,用于免疫应答机制的研究,克隆了斑马鱼myd88和traf6基因的编码区CDS全长序列,分别是855 bp和1 629 bp。结构分析表明,斑马鱼MYD88存在2个保守结构域为死亡结构域和TIR结构域,TRAF6存在4个保守结构域分别为RING结构域、2个锌指结构域、环-环(coiled-coil)结构域以及TRAF同源结构域(meprinand TRAF-homology, MATH),并与其他物种氨基酸序列一致性较高。系统进化树分析发现斑马鱼myd88和traf6基因与硬骨鱼类亲缘关系较近,说明斑马鱼myd88和traf6基因的同源性符合其在物种进化上的地位并且具有很高的结构同源性。将斑马鱼myd88和traf6基因的CDS全长序列连接至pCMV-Tag2B表达载体。通过对重组质粒进行双酶切检测发现,成功克隆了斑马鱼pCMV-myd88和pCMV-traf6真核表达载体。为了验证这2个真核表达载体的生物学功能,本研究在HEK293T细胞中进行NF-κB的报告基因活性检测。结果表明,过表达myd88和traf6基因后,斑马鱼NF-κB家族nfκb1启动子的转录活性显著升高,分别约为空载对照组的2.5倍和8倍。鉴于MYD88和TRAF6在天然免疫功能等方面的重要作用,实验结果为以后研究斑马鱼的先天免疫信号传导过程提供了有力的研究工具。
- 徐行徐行刘何奕张颖任建峰张颖任建峰
- 关键词：斑马鱼真核表达载体
- 斑马鱼deltaD基因对血管内皮生长因子家族基因(vegfaa和flt4)的调控作用被引量：2
- 2022年
- 为了探究斑马鱼(Danio rerio)deltaD基因对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族基因vegfaa和flt4的调控作用,本研究通过红色荧光转基因斑马鱼系的成像发现deltaD纯合突变体的节间血管(intersegmental vessels,ISVs)出现了生长紊乱的现象,RT-qPCR实验检测到受精后1 dpf(day post fertilization)大小的deltaD纯合突变体中VEGF家族的vegfaa配体和flt4受体基因的表达量均下调,且flt4基因的表达量显著性下调。之后应用双荧光素酶(Luciferase)实验体外验证deltaD基因对vegfaa和flt4的调控作用。利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器数据库获得斑马鱼deltaD、vegfaa及flt4基因序列,并成功构建表达载体p3xFLAG-CMV-deltaD和双荧光素酶报告基因表达载体pGL3-vegfaa-Luc、pGL3-flt4-Luc。双荧光素酶报告基因实验结果显示,pGL3-vegfaa-Luc和pGL3-flt4-Luc报告基因载体在HEK293T细胞中的荧光素酶活性分别约为对照组的92倍和3.9倍。进一步将p3xFLAG-CMV-deltaD分别与pGL3-vegfaa-Luc、pGL3-flt4-Luc转染至HEK293T细胞,发现与对照组相比其荧光素酶活性分别约为2.3倍和3.7倍。本研究明确了Notch信号通路的配体基因deltaD可以通过调控血管内皮生长因子家族中的vegfaa配体和flt4受体基因而影响血管发育,为深入研究Notch信号通路在血管发育中的调控机制提供实验材料和科学依据。
- 杜璇王子睿包林珠程瑶任建峰任建峰张庆华
- 关键词：斑马鱼FLT4
- 海七鳃鳗CXCL8基因的原核表达及蛋白纯化
- 2018年
- 海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进行表达,利用Bio-Rad IMAC蛋白质纯化试剂盒和Profinia蛋白质纯化系统进行纯化,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,PmCXCL8开放阅读框(open reading frame,ORF)为309 bp,编码102个氨基酸,分子量为11.23 kDa,等电点为9.37。PmCXCL8氨基酸序列中保守的C36和C38之间插入一个氨基酸残基,为CXC型趋化因子,而且不含ELR(Glu-Leu-Arg)基序,相应位置被GGR(Gly-Gly-Arg)所替代。原核表达对比发现,该蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中的表达优于E.coli BL21,最后通过亲和层析法纯化得到了高纯度的PmCXCL8重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定结果均得到单一的条带,分子量约为11.23 k Da,符合预期结果,表明已成功表达出可溶性良好的PmCXCL8重组蛋白。该研究为PmCXCL8功能的探究与抗体的制备提供了实验材料,也为七鳃鳗天然免疫系统进化的研究奠定了基础。
- 朱欣云丁少青张哲任建峰濮家飞贾亮李伟明张庆华
- 关键词：原核表达蛋白纯化
- 斑马鱼eomesb基因突变体的构建及其功能分析
- 2021年
- Eomesodermin(Eomes)是T-box转录因子基因家族的成员,在脊椎动物胚胎发育、模式形成和形态发生过程中发挥重要作用。斑马鱼(Danio rerio)eomesa基因的一个点突变导致其母源合子突变体胚胎发育延迟而大量死亡,而eomesa合子突变体可正常发育至性成熟,但缺失背鳍。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼eomesa旁系同源基因eomesb的突变体,eomesb纯合突变体不仅可正常发育至性成熟,而且鳍的发育也完全正常。q-PCR和整体原位杂交实验结果显示,eomesa和eomesb在脑部组织具有重叠的表达域,eomesb在中脑的表达略高于eomesa,故推测两基因在脑部可能行使相似的功能,存在一定的功能冗余。对2,4,6 dpf(Days post fertilization)和6 dpf的WT和突变体q-PCR基因表达分析显示,eomesb突变对eomesa的表达没有明显影响。eomesa^(-/-);eomesb^(-/-)双突变体未出现背鳍缺失以外的附加表型,推测斑马鱼eomesa和eomesb在背鳍发育过程中可能不存在功能冗余,eomesb不参与背鳍的发育过程。此外,整体原位杂交实验结果显示,eomesb突变也不影响其同源基因tbr1a和tbr1b的早期表达。eomesb纯合突变体未观察到明显表型,可能与其影响的功能不引起明显表型有关,也可能与其它基因的遗传补偿效应有关。本研究结果为深入研究斑马鱼eomesb基因的功能提供了实验材料,同时对研究eomesa与eomesb基因功能分化具有参考价值。
- 胡金萌杜博博宋诗颖张庆华任建峰
- 关键词：斑马鱼Q-PCR
- 利用CRISPR/Cas系统实现七鳃鳗双等位基因敲除
- 七鳃鳗是一种现存的最早的脊椎动物。通过对七鳃鳗的研究,我们可以对脊椎动物的早期进化特点有更好的理解。然而七鳃鳗的生活习性决定了传统的遗传学方法研究很难运用到七鳃鳗上面进行研究。在此,我们根据七鳃鳗的基因组信息构建了七鳃鳗...
- 祖尧张绪帅任建峰董雪红朱哲李伟明
- 关键词：七鳃鳗基因敲除无颌类
- 文献传递
- 斑马鱼notch1a对pka报告基因转录调控作用
- 2021年
- 目的通过双荧光素酶报告基因研究斑马鱼notch1a对pka的转录调控作用。方法利用NCBI数据库获得斑马鱼notch1a基因序列,克隆notch1a基因的胞内段NICD(Notch intracellular domain),构建pCMV-N1aICD表达载体,利用蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白的表达水平;利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器数据库获得斑马鱼pka基因的启动子序列,构建pGL3-pka报告基因载体,然后在HEK293T细胞系中证实构建的报告基因载体具有活性;将重组荧光素酶报告载体和N1aICD表达载体共转染HEK293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证notch1a胞内段对pka基因转录水平的调控作用。结果经测序验证克隆成功后,蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白能够正常表达,且蛋白大小与预测结果一致。双荧光素酶报告基因显示,pGL3-pka组活性为pGL3空载组的3.25倍。转染pGL3-pka和pCMV-N1aICD组活性为转染pGL3-pka和pCMV空载对照组的0.31倍。结论斑马鱼notch1a对pka启动子具有转录抑制作用。在骨形成和骨重建中,Notch通路可能通过调控pka来参与成骨与破骨细胞的分化。
- 张颖张颖季策李伟眀任建峰
- 关键词：斑马鱼骨质疏松PKA
- 糖原贮积症0型斑马鱼疾病模型的构建及表型分析被引量：1
- 2021年
- 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建糖原贮积症0(GSD0)型斑马鱼疾病模型,研究该病的发病进程和机制。方法针对gys1和gys2基因各设计一个靶点,进行基因编辑和突变体筛选;利用qPCR技术检测早期发育阶段和成鱼不同组织基因表达情况,通过PAS染色技术检测糖原累积情况。结果获得了gys1和gys2基因各两种有效突变类型的F2纯合突变体,成功构建了GSD0型斑马鱼疾病模型。gys^(1-/-)纯合子F3早期胚胎发育迟缓,48 hpf内全部死亡,而gys^(2-/-)纯合子发育正常。基因表达分析显示,野生型斑马鱼早期发育阶段(0~125 hpf),gys1和gys2的表达先下降后上升,受精卵时期表达最高;成鱼阶段,gys1在心脏和肌肉组织中高表达,gys2在肝中高表达。PAS糖原染色显示,与野生型相比,gys^(1-/-)心脏和肌肉没有明显的糖原积累,gys^(^(2-/-))肝没有明显的糖原积累。结论gys1和gys2基因敲除斑马鱼模型的表型与小鼠模型相似,但也存在差异;Gys1敲除小鼠模型中F2大部分纯合子死亡,斑马鱼gys^(^(1-/-))纯合子F2正常生长发育,而自交产生的F3不能存活。斑马鱼gys1和gys2敲除突变体的制备,为进一步研究人类糖原储存障碍GSD0的发病进程和机制提供了材料。
- 黄姣霍锦倩刘姣陈洁陈洁张庆华张庆华
- 关键词：疾病模型基因敲除
- 缢蛏Hsp基因家族全基因组鉴定及其在应激下的表达分析
- 2024年
- 热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)是一类广泛存在于动植物和微生物等多种生物体内的高度保守的蛋白质,能够被生物和非生物胁迫诱导表达。为了探究Hsp在缢蛏(Sinonovacula constricta)应对生物与非生物胁迫中的作用,本研究利用生物信息学方法,在缢蛏全基因组中共鉴定出62个ScHsp基因,对其基因结构、染色体定位和蛋白理化性质进行预测,并对ScHsp基因在不同组织和生物胁迫[副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)感染]及非生物胁迫(高温和干露胁迫)下的表达模式进行分析。结果表明,不同ScHsp家族基因内含子的数目存在较大差异,62个ScHsp基因不均匀分布在17条染色体上,基因复制分析发现有3组串联复制基因,这可能是ScHsp家族基因数目扩张的重要原因;多数ScHsp基因表达具有组织特异性,少数基因(ScHsp90-2和ScHsp70-11)呈现泛表达模式;副溶血弧菌感染和高温胁迫后,ScHsp家族基因都呈现不同程度的响应,根据基因表达的趋势分别分为6种和4种模式;对低温和常温干露胁迫5个时间点(0、12、24、48、72 h)下,ScHsp基因家族6个代表基因的表达量进行qPCR分析,结果显示6个基因都不同程度地响应干露胁迫,且表达模式不同。本研究为全面深入研究ScHsp家族基因在缢蛏应对胁迫反应作用机制提供基础资料。
- 姚璐李治平孔祥辉董迎辉任建峰
- 关键词：缢蛏热休克蛋白基因家族生物胁迫非生物胁迫
- 斑马鱼(Danio rerio)mapk1基因对tp53基因调控研究被引量：3
- 2021年
- 旨在研究斑马鱼(Danio rerio)mapk1基因对tp53基因的调控作用。通过生信网站分析斑马鱼tp53启动子序列与mapk1基因CDS序列,构建斑马鱼tp53启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-tp53-Luc和mapk1表达质粒pCMV-Tag2B-mapk1。利用Luciferase实验验证tp53启动子报告基因的活性,以及mapk1基因对tp53基因的活性影响。结果显示,斑马鱼tp53基因启动子区无CpG岛位点,包含Oct-1(TATGTAAAGC)、Sp-1(AGATCCCGCC)、c-Jun(CTGACGTCAC)、CREB(CTGACGTCAC)、CREBP1(CTGACGTCAC)、NF-kappa B1(AGGGGAATCC)和RAR-alpha1(TTGAACTTTT)共7个转录因子结合位点;斑马鱼与人和小鼠MAPK1氨基酸的一致性分别为91.33%和90.79%。pGL3-tp53-Luc在哺乳动物细胞系和鱼类细胞系中均具有很高的活性,分别是对照组的17倍和9倍。在HEK293T细胞中过表达pCMV-Tag2B-mapk1质粒后pGL3-tp53-Luc的luciferase活性是对照组的3倍左右。实验验证了斑马鱼mapk1基因可促进tp53基因的表达。
- 包林珠时灿卢玲儿徐行徐行任建峰任建峰张庆华
- 关键词：斑马鱼TP53报告基因
