孙菱
- 作品数:3 被引量:2H指数:1
- 供职机构:重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心更多>>
- 发文基金:重庆市教育委员会科学技术研究项目更多>>
- 相关领域:医药卫生生物学更多>>
- 新型基因组编辑蛋白FnCpf1的表达、鉴定及多克隆抗体的制备被引量:2
- 2017年
- 目的:构建土拉弗朗西丝菌Novicida亚种Cpf1蛋白编码基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化重组Fn Cpf1蛋白后,制备兔抗Fn Cpf1多克隆抗体。方法:利用PCR技术扩增Fn Cpf1基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度较高的Fn Cpf1蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备Fn Cpf1多克隆抗体,并用间接ELISA法检测兔抗血清效价、Western blot鉴定其特异性。结果:扩增得到3 900 bp的目的基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)后,通过双酶切及测序证实pET-32a(+)-Fn Cpf1表达载体构建成功,可诱导表达相对分子质量160 k D的目的蛋白,经SDS-PAGE分析其为可溶性,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度为95%以上的Fn Cpf1蛋白,制备多克隆抗体并检测兔抗Fn Cpf1抗血清ELISA效价达1:512 000,Western blot结果显示制备的抗体可较好地与Fn Cpf1蛋白特异性结合。结论:在原核系统中成功表达了Fn Cpf1重组蛋白,并用纯化后的蛋白制备出兔抗Fn Cpf1抗体,效价及特异性均良好,为进一步探讨Cpf1蛋白的生物学特性打下实验基础。
- 孙菱卢楠杨春康月茜杨婕何永林方陈城吴宣艳王瑜伟
- 关键词:多克隆抗体
- 利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响
- 2018年
- 目的:在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的m Cherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响。方法:通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒p KD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达。用同样的方法,将一段随机靶标序列引入p Tac-m Cherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的m Cherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活m Cherry荧光报告质粒p Q0、p Q40、p Q80、p Q120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为p Q0组、p Q40组、p Q80组及p Q120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率。结果:PCR及测序证实p KD46-Cas质粒及插入失活的m Cherry荧光报告载体p Q0、p Q40、p Q80、p Q120构建成功,Western blot鉴定p KD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示p Q0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义(P<0.05),重组修复效率与同源片段长度呈正相关(r=0.792,P<0.01)。结论:成功建立了基于m Cherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0~120 bp时其长度对重组效率有影响。此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台。
- 孙菱康月茜唐弘卢楠徐蕾杨婕庄稀尧王瑜伟杨春
- 分枝杆菌表达质粒的快速构建及ClpC2基因功能初步研究
- 2016年
- 目的通过一种不受到序列限制、酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,检测其在耻垢分枝杆菌中的蛋白表达并对其功能进行初步探讨。方法利用识别甲基化位点的内切酶Fsp EⅠ进行一步法酶切、连接反应,构建重组质粒PMV261(+)-Clp C2。将重组质粒转入耻垢分枝杆菌,利用SDS-PAGE和Western blot检测Clp C2基因在耻垢分枝杆菌中的表达以及氧化应激、酸应激对其功能进行初步探讨。结果利用Fsp EⅠ快速构建了分枝杆菌表达质粒Clp C2,将其成功电转至耻垢分枝杆菌中,SDS-PAGEA和Western blot检测其蛋白的表达,His单抗和兔多抗均能检测到目的条带,Mr大小27 570。氧化应激及酸应激实验表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌与空载耻垢分枝杆菌在对抗应激方面无明显差异。结论成功构建了一种不受序列限制的分子克隆方法以及分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,Western blot表明其具有一定的免疫原性,氧化应激及酸应激表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌对抗应激方面无明显改变,为进一步深入研究Clp C2基因的功能奠定了基础。
- 康月茜卢楠孙菱李岱容杨春
- 关键词:耻垢分枝杆菌CLP