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利用颗粒细胞筛选绵羊VEGFR有效干扰片段的研究: 2017年; 为了进一步探究血管内皮生长因子(VEGF)对绵羊卵母细胞成熟和胚胎发育的作用,试验采用电穿孔技术(Electroporation)将针对血管内皮生长因子受体(VEGFR)中的两个受体FLT1和KDR/FLK-1设计的6条双链小RNA导入到绵羊颗粒细胞内,通过实时定量PCR检测FLT1和KDR/FLK-1表达量的变化,筛选出针对VEGFR的有效干扰片段。结果表明:试验组F2(FLT1-siRNA-2)第1~3天的FLT1 mRNA相对表达量分别为7.17×10^(-6)±4.97×10^(-8)、5.92×10^(-6)±4.73×10^(-8)和1.14×10^(-5)±2.84×10^(-7),极显著低于其他FLT1试验组(P<0.01),且FLT1 mRNA相对表达量相差100倍或10倍;试验组K1(KDR/FLK-1-siRNA-1)第1~3天KDR/FLK-1 mRNA相对表达量分别为1.46×10^(-7)±6.08×10^(-9)、2.80×10^(-7)±1.82×10^(-8)和7.99×10^(-7)±2.60×10^(-8),极显著低于其他KDR/FLK-1试验组(P<0.01),且KDR/FLK-1 mRNA相对表达量相差100倍或10倍。从第4天开始试验组F2 FLT1 mRNA相对表达量和试验组K1 KDR/FLK-1 mRNA相对表达量逐渐增加,到达第9天与其他组趋于相近。最终确定针对FLT1和KDR/FLK-1最有效的干扰片段分别是FLT1-siRNA-2和KDR/FLK-1-siRNA-1。; 邹云龙石国庆阿依木古丽张国华周平杨具田徐红伟曹忻; 关键词：RNA干涉颗粒细胞绵羊

绵羊卵母细胞体外成熟过程中VEGF对DNMT3a表达的影响被引量：2: 2016年; 旨在探究血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对DNMT3a的影响。本研究采用RNA干扰和显微注射技术将针对VEGF两个受体FLT1和KDR/Flk-1的有效干扰片段导入到绵羊卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocytes complexes,COCs）中,检测体外成熟培养各时间卵母细胞和颗粒细胞中DNMT3amRNA和蛋白表达水平的变化。结果表明,COCs体外成熟培养过程中,无论是否添加VEGF,卵母细胞内DNMT3amRNA表达量都随着培养时间延续而降低,培养至8h时DNMT3amRNA表达量急速下降,之后下降速度放缓,至24h后各组趋于一致,且未注射干扰片段对照组的下降速度快于其他干扰组（P〈0.01）。添加VEGF组DNMT3amRNA表达量的下降速度快于未添加组。干扰片段导入后发现,FLT1-siRNA和KDR-siRNA复合干扰组干扰效果优于KDR-siRNA干扰组,FLT1-siRNA干扰组干扰效果最弱（P〈0.01）。无论是否添加VEGF,在COCs体外成熟培养过程中,颗粒细胞DNMT3amRNA表达量都随着培养时间延续而降低,且各组表达量差别不大。其中未注射干扰片段对照组的下降速度在COCs成熟培养中期快于其他干扰组（P〈0.05或P〈0.01）,FLT1-siRNA干扰效果较好。无论是否添加VEGF卵母细胞内DNMT3a蛋白表达量从0～4h上升,之后匀速下降,至16h急速下降,24h为零。未导入干扰片段对照组下降速度最快。其中16h对照组、FLT1-siRNA干扰组、KDR-siRNA干扰组和FLT1-siRNA＆KDR-siRNA复合干扰组DNMT3a蛋白表达量,添加VEGF后,分别下降到培养初期的23.12%、31.07%、41.47%和37.90%,未添加VEGF的组则分别下降到培养初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%。颗粒细胞中,添加VEGF组DNMT3a蛋白表达量呈现逐渐下降趋势,至20h时,已无DNMT3a蛋白表达;未添加VEGF组从0～4h有略微上升,之后呈现逐渐均速下降趋势,20h时,急速下降,至24h时,无DNMT3a蛋白表达,且干扰片段对DNMT3a蛋白表达影响�; 曹忻邹云龙蔡勇周平李明石国庆康相涛; 关键词：血管内皮生长因子卵母细胞绵羊体外培养

RNAi对绵羊颗粒细胞体外培养过程VEGF及其受体mRNA表达的影响被引量：2: 2017年; 【目的】明确RNA干扰(RNAi)对绵羊颗粒细胞体外培养过程中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体mRNA表达的影响,为开展VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础。【方法】采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内,利用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化。设定筛选出的Flt-1和KDR/Flk-1有效干扰片段分别为试验组Ⅰ和试验组Ⅱ,两个干扰片段共同作用为试验组Ⅲ,无效的干扰片段为对照组。【结果】绵羊颗粒细胞体外培养过程中,VEGF mRNA在各时间段的相对表达量是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍;培养第1 d时,试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组ⅢVEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2,均极显著高于对照组(P<0.01,下同),3个试验组的VEGF mRNA表达量从第2 d开始降低,直到第6 d与对照组趋于一致。试验组ⅡFlt-1 mRNA相对表达量从培养第1 d的1.02×10-1逐渐降至第7 d的8.99×10-4,且一直极显著高于其他组;试验组Ⅰ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无Flt-1 mRNA表达,随着培养时间的延长逐渐呈上升趋势,第8 d时各组趋于一致。试验组Ⅰ的KDR/Flk-1 mRNA相对表达量从第1 d开始极显著低于对照组;试验组Ⅱ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无KDR/Flk-1 mRNA相对表达,随着培养时间的延长呈上升趋势,第9 d时各组趋于一致。【结论】两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用,可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量,进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输。; 曹忻邹云龙徐红伟杨具田; 关键词：血管内皮生长因子受体 RNA干扰(RNAI)颗粒细胞绵羊

绵羊卵母细胞3种体外培养方式下外源添加血管内皮生长因子对FLT-1表达的影响被引量：1: 2018年; 本研究旨在探究外源添加血管内皮生长因子(VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟过程中FLT-1表达的影响。采用3种不同的体外成熟培养方式:裸卵单独培养、颗粒细胞与裸卵共培养以及卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocytes complexes,COCs)培养,外源添加5ng·mL-1血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)为试验组,不添加为对照组,采用qPCR、Western blot分别检测绵羊卵母细胞及颗粒细胞中FLT-1mRNA和蛋白表达水平。结果表明:1)3种不同培养方式下,无论是否添加VEGF,颗粒细胞与卵母细胞中均能检测到FLT-1mRNA和蛋白表达。添加VEGF能极显著降低共培养试验组12、16和20h以及COCs试验组4、8、12、16和24h颗粒细胞FLT-1mRNA表达(P<0.01),能极显著降低共培养试验组12、20和24h以及COCs试验组4、8和12h卵母细胞FLT-1mRNA表达(P<0.01),但会极显著增加裸卵试验组4~24h卵母细胞FLT-1mRNA表达(P<0.01)。2)添加VEGF能够极显著降低共培养试验组和COCs试验组中颗粒细胞FLT-1蛋白4~12h的表达量(P<0.01),共培养试验组和COCs试验组中颗粒细胞FLT-1蛋白表达呈波动性下降趋势。COCs对照组和试验组颗粒细胞中FLT-1蛋白表达量在各时间点均高于同期共培养试验组。3)3种不同培养方式中,除裸卵试验组在20~24h有一个急剧升高外,其余组中卵母细胞FLT-1蛋白表达量总体均呈波动性下降趋势。综上表明,卵母细胞和颗粒细胞中存在FLT-1的自分泌和旁分泌,卵母细胞中FLT-1mRNA的表达与外围颗粒细胞的存在与否、数量多少以及包裹方式息息相关;在体外培养环境下,添加VEGF有效地激活了FLT-1mRNA表达,但同时结合FLT-1蛋白以促进卵母细胞成熟的生物学效应,从而减少了FLT-1蛋白的表达。; 曹忻邹云龙陆会宁高丹丹周平石国庆杨具田; 关键词：绵羊卵母细胞血管内皮生长因子血管内皮生长因子受体1

天祝白牦牛转铁蛋白(Tf)基因克隆及生物信息学分析: 2015年; 目的:克隆天祝白牦牛转铁蛋白(Transferrin,Tf)基因,并对其序列及蛋白进行遗传特性分析,为研究Tf生物学作用和生产应用提供理论依据。方法 :以成年天祝白牦牛肝脏组织为实验材料,根据牦牛Tf基因CDS区序列设计引物,利用PCR和逆转录PCR(reverse transcription,RT-PCR)技术克隆获得天祝白牦牛Tf基因编码区序列,并结合生物信息学方法分析其遗传特性。结果:PCR扩增获得了大小为2 115 bp的基因片段,为Tf基因的完整编码区,编码704个氨基酸,其N端有一个19个氨基酸组成的信号肽,含2个高度保守的同源结构域,N端结构域组成为第25到363位氨基酸(339aa),C端结构域组成为第364-693位氨基酸(330aa),两端结构域的同源性为42%;Tf基因编码的蛋白分子量为75.78 k Da,理论等电点为6.63。序列分析显示,克隆获得的Tf基因序列存在4个碱基的变异,第57位发生碱基转换(A←→G),第750位发生碱基转换(T←→C),为同义突变;第482位发生碱基转换(A←→T),第511位发生碱基转换(T←→C),为错义突变,引起第161、171位氨基酸发生改变(L→G、L→F)。DNAman软件进行氨基酸同源性分析表明,天祝白牦牛Tf基因氨基酸序列与野牦牛、牛、水牛、藏羚羊、绵羊、野猪、人、鼠、鸡和鱼Tf氨基酸序列间的同源性分别为100%、99%、96%、94%、93%、75%、69%、64%、51%、39%,说明天祝白牦牛Tf蛋白与其他物种同源,与牛类进化水平较为接近,与鸡和鱼类进化水平较远。同源建模预测Tf三级结构模型显示,天祝白牦牛Tf三级结构是在二级结构基础上经肽链折叠形成2个邻近相似的N端、C端结构域,N端结构域含N1、N2两个亚基,C端结构域含C1、C2两个亚基。结论:从天祝白牦牛肝脏组织中提取总RNA,克隆获得Tf基因编码区全长序列,并揭示了其分子遗传特性,为牦牛Tf蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。; 达小强徐红伟蔡勇曹忻牛荇洲邹云龙柏家林臧荣鑫杨具田; 关键词：天祝白牦牛

包装盒（猫咪粮食）: 1．本外观设计产品的名称：包装盒（猫咪粮食）。;2．本外观设计产品的用途：本外观设计产品用于产品的包装。;3．本外观设计产品的设计要点：形状图案及色彩的结合。;4．最能表明本外观设计设计要点的图片或照片：主视图。;5．请...; 曹忻邹云龙

包装盒（幼犬专用粮）: 1．本外观设计产品的名称：包装盒（幼犬专用粮）。;2．本外观设计产品的用途：本外观设计产品用于产品的包装。;3．本外观设计产品的设计要点：形状图案及色彩的结合。;4．最能表明本外观设计设计要点的图片或照片：主视图。;5．...; 曹忻邹云龙

包装盒（成犬专用粮）: 1．本外观设计产品的名称：包装盒（成犬专用粮）。;2．本外观设计产品的用途：本外观设计产品用于产品的包装。;3．本外观设计产品的设计要点：形状图案及色彩的结合。;4．最能表明本外观设计设计要点的图片或照片：主视图。;5．...; 曹忻邹云龙

日粮不同蛋白质水平对绵羊IGF-1和GH分泌及基因表达的影响被引量：15: 2015年; 本研究旨在探讨不同蛋白质水平日粮对绵羊胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和生长激素(GH)分泌及基因mRNA表达量的影响,为科学配置肉羊饲料及研究肉羊生长发育提供基础。选择6月龄体重相近的多胎萨福克公羔18只,随机分为3组,分别饲喂不同蛋白质水平的日粮(低蛋白日粮、中蛋白日粮和高蛋白日粮)。采用ELISA方法和SYBR Green Real-time PCR方法检测日粮不同蛋白质水平对不同生长发育阶段(30、60、90和120d)羔羊外周血中IGF-1、GH浓度和皮肤组织中基因表达的影响。结果显示,日粮蛋白质水平显著影响绵羊平均日增重、外周血中IGF-1和GH的浓度以及皮肤组织IGF-1基因的表达丰度,而未显著影响GH基因的表达丰度。结果提示,随着日粮蛋白质水平的升高,绵羊生长发育快,外周血中IGF-1浓度增加,GH浓度降低,IGF-1基因表达量增加。; 闫云峰杨华杨永林潘晓亮邹云龙; 关键词：绵羊蛋白水平 IGF-1 GH 基因表达

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邹云龙

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