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Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究被引量：3: 2020年; 构建脂肪特异性蛋白27(Fat-specific protein of 27,Fsp27)基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05),其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05);油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。; 许祥董维鹏张少华冯晨毅刘田福燕炯; 关键词：RNA干扰 3T3-L1前脂肪细胞脂解

围脂滴蛋白基因CRISPR/Cas9载体的活性分析被引量：2: 2019年; 设计并验证能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA,为建立高效的PLIN1基因敲除动物模型奠定基础。利用预测软件设计3条评分较好的sgRNA。添加T7启动子后体外转录相应的sgRNA,构建酶切体系并验证其体外切割活性。构建相应的基因敲除质粒载体,通过电转染将质粒转到3T3-L1前脂肪细胞内并进行诱导分化。RT-PCR法检测细胞中PLIN1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PLIN1蛋白的表达。成功在体外转录3条PLIN1的sgRNA并构建酶切体系,测得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8%±9.0%,sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1%±9.6%,sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1%±7.2%,sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组(P<0.05)。成功构建3条sgRNA的质粒载体并电转染进入3T3-L1前脂肪细胞内,转染效率约为30%。诱导分化的第4天,各阳性干扰组PLIN1 mRNA的表达量显著降低(P<0.01);与sgR NA-PLIN1-3组相比,sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组PLIN1 mRNA的表达量有显著性差异;各阳性干扰组PLIN1蛋白的表达量显著降低(P<0.01),阳性干扰组相互之间PLIN1蛋白的表达量无显著性差异。3条sgRNA皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子,其中gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的切割活性略高于sgRNA-PLIN1-3组。体外活性切割实验可以很好的预测细胞内切割效果,是筛选高活性sgRNA的有效手段。; 许祥董维鹏张少华冯晨毅刘田福燕炯

CRISPR系统及其应用于小鼠的研究进展被引量：2: 2018年; CRISPR系统作为一种基因编辑工具,自2013年首次应用于哺乳动物以来,凭借其设计简单,耗时短,效率高的优点,在短短四年间飞速发展,其应用已经远远超过了锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶技术,并在分子生物学领域得到广泛应用。基于该系统发展而来的各项技术不断的被发掘,小鼠作为一种基本的实验动物,在CRISPR系统应用中扮演重要角色。目前基于CRISPR系统发展而来的应用工具已经成功的作用于各种体外培养的细胞,通过对胚胎细胞的编辑而产生动物模型的技术也在不断成熟,以及在疾病治疗特别是遗传病治疗中也展现出其独有的优势,并且其作用范围在不断的扩展,作用方式还在不断的创新。主要介绍CRISPR系统的结构与作用原理,讲述基因敲入、基因敲除、基因沉默、转录调控等作用于DNA的几种主要的CRISPR应用工具,针对目前主要的缺点即脱靶效应所研究出的几个改善措施,以及在小鼠疾病模型建立与疾病治疗中发挥的重要作用。; 董维鹏王君实张少华燕炯; 关键词：基因调控小鼠

下调Fsp27基因表达联合杨梅素干预对3T3-L1细胞脂解的影响被引量：2: 2018年; 目的下调脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因表达联合杨梅素干预,观察对3T3-L1细胞中脂质代谢的影响,并探究脂滴发生、发展变化的调控机制。方法常规培养3T3-L1前脂肪细胞,采用“鸡尾酒”法诱导其分化为成熟脂肪细胞。脂质体法转染sh-Fsp27干扰载体,以杨梅素浓度为100μmol/L的完全培养基干预成熟脂肪细胞72h。油红O染色,观察脂滴形态及大小的变化;酶法测定细胞内甘油及甘油三酯的含量,观察细胞脂质代谢的变化。Westernblot检测Fsp27、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白的表达。结果1.3T3-L1细胞诱导分化后,形态由纤维样变成圆形,并伴随有细胞体积的增大。2.与对照组相比,杨梅素组和转染组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05)。与其他三组相比,联合干预组细胞中甘油三酯含量减少,甘油含量增加(P<0.05)。3.与对照组相比,其余三组细胞内Fsp27蛋白的表达量均降低,ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05)。另外,联合干预组和杨梅素组细胞内HSL的表达量和p-p38MAPK/p38MAPK的比值均大于sh-Fsp27组和对照组(P<0.05)。结论1.Fsp27基因沉默与杨梅素联合干预可以更大程度地促进脂肪分解代谢。2.杨梅素可通过激活MAPK信号通路,上调HSL和ATGL的蛋白表达来发挥其促脂解的作用;sh-Fsp27干扰载体通过调节PPARγ和Fsp27蛋白的表达,增加ATGL含量来加速脂肪分解。; 董维鹏张少华许祥燕炯; 关键词：3T3-L1前脂肪细胞脂肪水解

下调Perilipin 1基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响被引量：9: 2016年; 目的:研究下调围脂滴蛋白基因(PLIN1)表达对3T3-L1细胞脂解的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建3组阳性及1组阴性sh-PLIN1重组载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定。Western blot测定PLIN1A蛋白表达,评价载体下调效果。细胞转染有效载体2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶学方法测定细胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot检测甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。结果:各sh-PLIN1干扰载体构建成功,且3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P<0.05)。转染有效载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相对表达量显著升高(P<0.05),p-HSL相对表达量及c AMP、PKA的浓度无显著性差异(P>0.05)。结论:下调PLIN1基因表达可加快3T3-L1细胞脂解速率,其可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,c AMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。; 赵志武王君实马敏张少华燕炯; 关键词：细胞转染 3T3-L1前脂肪细胞脂解

SDG对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤炎性相关因子影响: 2016年; 目的探讨开环异落叶松树酯酚二葡萄糖苷(SDG)对雌性去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用及机制。方法选取无特定病原(SPF)级健康SD雌性10周龄大鼠50只,按体重随机分为2组:去卵巢组、对照组,去卵巢组又分为假手术组、缺血再灌注组、雌二醇组、SDG组。SDG组以50 mg/kg剂量灌胃,雌二醇组以0.8 mg/kg剂量灌胃,其余组均以等量蒸馏水灌胃。结果与假手术组比较,缺血再灌注组大鼠体重[(348.21±7.45)g]增加,子宫指数[(0.69±0.36)mg/g]降低,大鼠血清中炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平[分别为(149.52±17.12)、(174.74±15.72)、(79.53±7.07)ng/L]升高,血清一氧化氮(NO)水平、心肌组织中结构型一氧化氮合酶(c NOS)活力[分别为(15.67±0.68)μmol/L、(0.255±0.069 0)U/mgprot]降低;与缺血再灌注组比较,SDG组大鼠体重[(275.42±3.40)g]下降,子宫指数[(1.53±0.31)mg/g]升高,大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6[分别为(86.10±2.91)、(127.66±8.86)、(46.63±4.13)ng/L]明显降低,大鼠血清NO水平、心肌组织中c NOS活力[分别为(46.49±1.32)μmol/L、(0.496±0.052)U/mgprot]升高。结论SDG干预对缺血再灌注损伤大鼠具有一定保护作用,其机制可能与降低血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平,提高血清中NO含量、增加心肌组织中c NOS活力有关。; 王君实马敏赵志武张少华燕炯; 关键词：心肌缺血再灌注卵巢切除术

PI3K-Akt-eNOS信号通路在SDG抑制去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤中的调控作用被引量：4: 2016年; 目的:通过研究开环异落叶松树酯酚二葡萄糖苷(SDG)对心肌缺血再灌注去卵巢大鼠心脏组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)的影响,探讨SDG对心肌缺血再灌注损伤的保护机制。方法:100只SD雌性大鼠随机分为去卵巢组、缺血再灌注假手术组、缺血再灌注组、雌二醇干预组和SDG干预组。SDG干预组以50mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量灌胃,雌二醇干预组以0.8mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量灌胃,其余组均以等量蒸馏水灌胃。伊文氏蓝和2,3,5-氯化三苯基四氮唑双染色法测定心肌梗死面积,ELISA双抗体夹心法检测雌激素水平变化,Western blot法测定PI3K、Akt、eNOS以及三者磷酸化蛋白以及雌激素受体α(ERα)蛋白的表达。结果:SDG干预60d后,雌二醇干预组和SDG干预组雌激素水平显著高于缺血再灌注组,而心肌梗死区面积百分比显著低于缺血再灌注组(P<0.05)。此外,雌二醇干预组和SDG干预组中p-PI3K、p-Akt、peNOS和ERα4种蛋白的表达均显著高于缺血再灌注组(P<0.05)。结论:SDG可能通过激活雌激素受体α,活化PI3K-Akt-eNOS信号通路,从而对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。; 王君实马敏赵志武张少华燕炯

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张少华

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