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捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定被引量：2: 2017年; 【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L^(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L^(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1) MgCl_2,60μmol·L^(-1)CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L^(-1)的反应体系(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1)MgCl_2,60μmol·L^(-1) CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.; 郑秀平丁豪杰郭筱璐杨怡黄艳陈学秋周前进杜爱芳; 关键词：捻转血矛线虫原核表达酶活测定

Hc-fau基因结构域功能及Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究: 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)为吸血性寄生虫,能够在L4早期阶段进入滞育状态来躲避不利于自身生存的恶劣条件。本研究旨在研究Hc-fau基因各结构域所发挥的功能以及Hc-FAU天然融合蛋白特性分析...; 郭筱璐闫宝龙杨怡黄艳丁豪杰郑秀平陈学秋杜爱芳; 关键词：捻转血矛线虫

鹌鹑常见疫病及防控对策: 2016年; 鹌鹑肉和鹌鹑蛋具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点,营养价值高,具有＂动物人参＂的美誉. 早在20世纪,鹌鹑养殖就已成为养殖业热点,目前我国已成为鹌鹑养殖业最发达的国家之一,养殖的商品鹌鹑主要有蛋用型鹌鹑和肉用型鹌鹑,其中蛋用鹌鹑主要有日本鹌鹑、中国白羽鹌鹑、黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑、自别雌雄配套系鹌鹑;肉用鹌鹑主要有法国迪法克肉用鹌鹑、中国白羽肉用鹌鹑、法国菲鹌鹑、美国加利福利亚鹌鹑、法拉安肉用鹌鹑、莎维麦脱肉用鹌鹑等.; 黄艳丁豪杰杨怡陈学秋杜爱芳; 关键词：鹌鹑蛋防控对策常见疫病自别雌雄配套系肉用鹌鹑低胆固醇

鸦胆子提取物BJ-1抗鸡球虫病作用研究: 鸦胆子提取物BJ-1具有抗多种原虫的作用,但是关于其潜在的抗球虫作用尚未有研究报道.为研究BJ-1对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)引起的肉鸡球虫病的治疗作用,我们制备了BJ-1饲料预混剂.将SPF级肉鸡分为6组,分...; 蓝丽华左保杏子丁豪杰黄艳陈学秋杜爱芳; 关键词：中药提取物抗球虫肉鸡柔嫩艾美耳球虫

捻转血矛线虫-胃癌细胞共培养模型的建立及互作研究: 捻转血矛线虫早期感染会引起宿主胃组织的病理反应，诱发宿主的早期免疫应答，如表达分泌警报因子，敦促宿主尽快建立完整的Th2型免疫保护力。本试验旨在建立捻转血矛线虫体外培养模型，并在此基础上研究体外线虫感染早期免疫应答。使用...; 杨怡郭筱璐丁豪杰郑秀平黄艳陈学秋杜爱芳; 关键词：捻转血矛线虫 MGC BGC 细胞坏死

大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库的构建与鉴定被引量：2: 2016年; 为了构建大容量、天然鼠源核糖体展示(ribosome display,RD)单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库。通过提取SPF级小鼠脾脏总RNA,反转录为cDNA,利用引物分别扩增鼠抗体的VH、VL和Cκ基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,通过Linker((Gly4Ser)3)相互拼接,构建单链抗体scFv基因文库和核糖体展示基因文库;经连接转化,对所构建基因文库进行菌落PCR鉴定和序列测定分析。所构建核糖体展示基因文库库容量约为5.6×1013,基因片段全长大小约为1 100bp,基因文库序列具有较好的完整性和多样性。本试验成功构建了一个大容量、天然鼠源核糖体展示单链抗体文库,为进一步筛选单链抗体奠定基础。; 程海卫陈一飞丁豪杰杨怡卓洵辉郭筱璐陈学秋杜爱芳; 关键词：核糖体展示基因文库单链抗体

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丁豪杰

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