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靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究被引量：3: 2017年; 目的:制备靶向人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T),观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果:酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素(interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加(P<0.01)。结论:该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。; 徐亚如周荧唐奇刘振云黄骁辰杨婷婷张慧林赵薇蒯兴旺仇镇宁朱进冯振卿; 关键词：卵巢癌

人源全分子抗c-Met抗体的制备及对鼻咽癌细胞生物学特性的影响被引量：4: 2016年; 目的 :利用基因工程技术制备全分子人源抗c-Met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:设计引物扩增抗c-Met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体p FUSECHIg-h G1和p FUSE-CLIg-hκ中。转染真核细胞,表达产物用Protein A柱纯化。通过ELISA、Western blot和免疫荧光等方法鉴定该抗体的免疫学特性。CCK-8检测抗体对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,划痕实验、Transwell侵袭实验分析抗体对人鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:成功重组全分子人源抗c-Met抗体的表达载体,获得的全分子抗体保留了与抗原的特异性结合活性。CCK-8实验中结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞CNE2和HONE1的增殖。细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性细胞CNE2和HONE1的迁移和侵袭能力。结论:本研究成功制备人源全分子抗c-Met抗体,该抗体有明显的中和活性,为探索鼻咽癌分子靶向治疗奠定了基础。; 白璐月刘金荣唐奇熊四平陈雅杜银娟周荧朱进陈仁杰; 关键词：鼻咽癌 C-MET 人源抗体

人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定: 2016年; 目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体。应用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性。结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg。结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用。; 耿以如熊四平唐奇张晓陈雅徐亚如周荧仇镇宁冯振卿朱进; 关键词：狂犬病毒中和活性

人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定被引量：4: 2016年; 目的 :将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体Ig G,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性。方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建全分子Ig G抗体重、轻链表达载体,共转染293 Free Style(293F)细胞,表达并纯化Ig G抗体。应用ELISA及Western blot实验检测抗体免疫学活性,微量中和实验及鸡胚预防保护实验检测其中和活性,血凝抑制试验判断其结合血凝素亚基。结果:成功筛选出1株全人源抗H7N9血凝素Fab抗体基因并构建Ig G真核表达载体。获得的全分子Ig G抗体重、轻链序列正确,并可特异性结合H7N9血凝素。微量中和实验证明其对H7N9型禽流感病毒有良好中和活性,中和滴度为15.6μg/m L。鸡胚预防保护实验显示抗体用量为200μg时可达100%保护率。血凝抑制试验表明其结合血凝素HA2亚基。结论:制备的重组全人源全分子抗H7N9血凝素Ig G抗体可特异性识别H7N9型禽流感病毒血凝素,对H7N9型禽流病毒有显著的中和作用,为进一步研发用于禽流感防治的抗体药物奠定基础。; 陈雅熊四平唐奇王怡雯耿以如顾慧徐亚如周荧仇镇宁冯振卿朱进; 关键词：血凝素中和抗体

靶向c-Met嵌合抗原受体T细胞的制备及其对鼻咽癌细胞作用的研究被引量：1: 2017年; 目的构建靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)逆转录病毒载体,制备靶向c-Met CAR-T,观察其对c-Met阳性鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法利用基因工程技术构建抗c-Met scFv,并将其重组到含有CD28,CD137,CD3ζ等的逆转录病毒载体中,形成c-Met CAR逆转录病毒载体,测序确认。以该病毒载体感染T淋巴细胞,通过Western blotting检测c-Met CAR在T淋巴细胞中的表达。CCK-8检测c-Met CAR-T对鼻咽癌细胞的作用;通过ELISA检测c-Met CAR-T作用后IFN-γ、IL-2的变化。结果测序结果显示c-Met CAR病毒载体序列正确;Western blotting可检测到CD3ζ的表达;CCK-8结果显示,c-Met CAR-T明显抑制c-Met阳性的鼻咽癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA结果显示,c-Met CAR-T作用后分泌IFN-γ、IL-2明显增加(P<0.01)。结论成功制备了靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。该嵌合抗原受体能在T细胞中表达,能有效抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。; 周荧徐亚如黄骁辰陈渊章明炯张大为唐奇朱进陈仁杰; 关键词：C-MET 鼻咽肿瘤

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