目的构建人survivin基因sh RNA重组腺病毒载体,为缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)的基因治疗研究提供实验基础。方法构建su r v iv i n-si R NA表达质粒,测序鉴定正确后,将su r v iv i n-si R NA表达质粒与含有腺病毒右臂的骨架质粒p BHGE3共转染至人293A细胞,包装成腺病毒Ad-survivin并扩增,TCID50法测定病毒滴度。将人肺动脉平滑肌细胞缺氧培养24 h,并将细胞分为空白对照组(Con组),阴性对照组(Ad-Lac Z组),不同Adsu r vivin序列的干扰组(sh1组、sh 2组、sh3组)。Ad-su r vivin感染缺氧人肺动脉平滑肌细胞,Wester n blot检测su r vivin蛋白,验证重组腺病毒干扰效果。结果 (1)将sh RNA片段与p Ad-U6-CMV连接后的质粒进行测序,结果提示目的基因片段插入成功;(2)TCID50法测定病毒Ad-survivin-sh RNA1、Ad-survivin-sh RNA2和Ad-survivin-sh RNA3的滴度分别是1×1010,1.2×1010,1×1010;(3)sh2组缺氧人肺动脉平滑肌细胞内survivin蛋白表达明显低于其他4组(P<0.05)。结论本研究成功构建人survivin腺病毒载体,为研究survivin基因在缺氧性肺动脉高压中的作用提供了实验基础。
