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何芳: 作品数：21 被引量：110H指数：5; 供职机构：四川大学华西医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金四川省应用基础研究计划项目国家高技术研究发展计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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乙肝核酸疫苗pCI/S_2S接种小鼠后的免疫应答研究: 2007年; 目的构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应。方法从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S。将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达。结果小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答。此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达。结论乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。; 何煦赵连三周陶友何芳江南; 关键词：乙肝核酸疫苗体液免疫应答细胞免疫应答

乙肝核酸疫苗对荷瘤小鼠免疫保护作用的实验研究: 2007年; 目的观察乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,及对表达HBV preS2S抗原的SP2/0-S2S肿瘤细胞攻击的保护作用。方法将BALB/c小鼠随机分为3组,于0、4及8周分别接种pCMV-S2S(实验组)、乙肝表面抗原蛋白疫苗(HBsAg,对照组1)、空载质粒(pCMV,对照组2)各3次。末次免疫后4周,每组各取3只小鼠,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性。各组其它小鼠均用于肿瘤细胞攻击实验:分别于一侧胁部皮下种植SP2/0-S2S细胞,同时于另一侧种植不表达HBV preS2S抗原的SP2/0-CMV细胞作阴性对照。种植肿瘤细胞(荷瘤)后观察成瘤时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间及生存率。结果pCMV-S2S组CTL活性为(34.21±1.38)%,高于HBsAg组〔(19.64±1.50)%〕和pCMV组〔(3.45±1.89)%〕(P<0.05)。荷瘤后10d,pCMV-S2S组小鼠SP2/0-S2S细胞的成瘤率为58.3%,低于SP2/0-CMV细胞的成瘤率(91.7%)(P<0.05);两对照组SP2/0-S2S细胞与SP2/0-CMV细胞的的成瘤率无明显差异。荷瘤后pCMV-S2S组初次出现死亡小鼠的时间为24d,较两对照组均延迟了13d,平均生存时间为(31±1)d,较两对照组延长(P<0.05);4周生存率(75%)高于两对照组(P<0.05),两对照组之间生存时间及生存率差异无统计学意义。结论HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,对荷瘤小鼠具有特异性免疫保护作用,可望用于HBV感染的免疫保护。; 何芳唐红刘丽赵连三刘聪; 关键词：核酸疫苗细胞毒性T淋巴细胞免疫保护

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究: 2009年; 目的:我们先前的研究证明HMGN2(high mobility group nucleosomal-binding domain2)是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法:应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3d和第6d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg),采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBVDNA的含量。结果:从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBVDNA拷贝数。结论:HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。; 孔祥丽张平何芳张敏唐红冯云吴琦黄宁王伯瑶; 关键词：HMGN2 抗病毒活性肝炎病毒乙型

携带丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的重组腺病毒构建研究被引量：2: 2005年; 目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)的复制缺陷型重组腺病毒,为防治HCV感染的基因免疫和基因治疗提供实验基础。方法将HCV NS3基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增。结果通过PCR扩增、酶切、核酸测序及Western杂交法检测鉴定,均证实插入穿梭质粒中的片段为HCV NS3基因(基因型1b);所包装出的复制缺陷型重组腺病毒AdEasy-GFP-NS3具有良好的感染能力,并可在293细胞中表达HCV NS3蛋白。结论AdEasy-GFP-NS3携带有HCV NS3基因,能有效地感染293细胞并高效表达,从而为丙型肝炎基因疫苗的进一步研究奠定了基础。; 周陶友陈敏李卫华赵连三何芳刘丽唐红; 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白3 重组腺病毒疫苗基因治疗

乙肝病毒核酸疫苗诱导BALB/c小鼠特异性免疫应答: 2008年; 目的观察含乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)preS2S基因的核酸疫苗免疫小鼠后的特异性免疫应答。方法将BALB/c小鼠随机分为4组分别肌肉接种pCMV-S2S、乙肝表面抗原(HBsAg)、空载质粒(pCMV)及生理盐水(NS)。免疫组织化学法检测接种局部组织preS2S抗原的表达,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体Anti-HBs。结果pCMV-S2S组小鼠肌肉细胞中有较多量的preS2S蛋白表达,其它小鼠肌肉细胞中均未检出preS2S蛋白表达。pCMV-S2S组小鼠CTL活性为(32.10±1.93)%,明显高于各对照组(P<0.05)。pCMV-S2S组小鼠8周后Anti-HBs阳性率最高为42.9%。HBsAg组小鼠4周时Anti-HBs阳性率即达到100%。pCMV组及NS组小鼠血清中均未检测出Anti-HBs。结论乙肝核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内表达preS2S蛋白,并能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,也能诱生一定程度的特异性体液免疫应答。; 何芳唐红刘丽刘聪赵连三; 关键词：核酸疫苗免疫应答

表达乙肝病毒preS2S蛋白的荷瘤小鼠模型的建立: 2008年; 目的:建立能表达乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,为研究HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用提供简便易行的研究模型。方法:以免疫印迹法验证SP2/0-S2S细胞中有HBVpreS2S抗原的稳定表达,将SP2/0-S2S细胞种植到BALB/c小鼠胁部皮下(荷瘤),观察能否生长成瘤,以及成瘤的时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间;以免疫组织化学法检测小鼠肿瘤组织HBVpreS2S抗原的表达。以不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠作为阴性对照。结果:荷瘤后3天～1周,SP2/0-S2S细胞可在小鼠皮下形成实体肿瘤,成瘤率为100%,肿瘤细胞中有preS2S抗原表达,荷瘤后小鼠的平均生存时间为16±1天;与不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠相比,成瘤率、成瘤时间、肿瘤大小及生存时间差异。结论:建立了能表达HBVpreS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用于HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用的实验研究。同时也建立了不表达preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用作阴性对照。; 何芳唐红刘丽刘聪赵连三; 关键词：乙型肝炎病毒 BALB/C小鼠

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制被引量：2: 2008年; 目的观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响。方法应用高压注射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northern印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平。结果野生型及HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制。结论HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制。; 侯全玲唐红何芳刘丽刘凤君程星何小燕韩红霞黄飞骏; 关键词：乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒X蛋白转录

乙型肝炎病毒基因型研究新进展被引量：32: 2006年; 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科,由于HBV复制过程中HBV DNA聚合酶缺乏校正功能,导致HBV容易发生突变．根据基因序列差异的多少,可将HBV划分为A-H 8种基因型,其中A,B,C,F 4介基因型还可以划分为不同的亚型．HBV基因型呈一定的地理区域性分布．并且HBV基因型对于探讨HBV的传播途径,HBV携带者的流动形式以及变异株在不同人群中的流行情况都有很重要的意义．HBV基因型之间结构和功能的差异均可影响慢性HBV感染者在临床诊治过程中出现的基因变异、病情预后以及对抗病毒治疗的反应性．虽然近几年对HBV基因型的研究迅速增多,但尚处于探索阶段对其研究仍任重而道远．; 刘兴唐红何芳; 关键词：乙型肝炎病毒基因型

高灵敏化学发光法体外HBV转录与复制水平的检测体系被引量：6: 2006年; 目的:建立一套稳定的化学发光法体外HBV 转录与复制水平检测体系．方法:将人肝癌细胞株HepG2和可产生复制型HBV颗粒的HepG2．2．15细胞培养3 d,收集细胞均分为两份,分别抽提细胞总RNA 和HBV复制中间体DNA．以地高辛标记的 HBV重组质粒pHBV4．1作为探针,分别进行 Northern及Southern吸印杂交,以化学发光法检测杂交结果．将pHBV4．1以对数级差稀释后分别点样于尼龙膜用作内标,同时进行杂交及检测．结果:HepG2．2．15细胞提取物中检测出较强的HBV转录产物:3．5 kb,2．4／2．1 kb HBV mRNA的信号,及较强的HBV复制产物:HBV 复制中间体DNA的信号．HepG2细胞提取物检测结果均为阴性．内标检测信号强度随点样浓度逐渐递减而减弱,检测的灵敏度可达到 1 Pg,接近同位素法检测的敏感度．整个实验重复3次以上结果均相似．结论:成功建立了一套稳定的高灵敏化学发光法体外转录与复制水平检测体系．; 何芳唐红刘丽刘丽王甦刘凤君赵连三王甦; 关键词：乙型肝炎病毒转录化学发光法

表达丙型肝炎病毒NS3抗原的重组腺病毒构建及体外表达被引量：4: 2005年; 为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd NS3,并检测其在体外表达。应用PCR从真核表达质粒pRC/NS3 中扩增编码HCV NS3 蛋白(329-935aa)的基因片段,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带HCV NS3基因的重组腺病毒基因组质粒pAd HCV NS3,转染293 细胞,成功包装出重组腺病毒RAd NS3,利用它有效地感染人肝癌细胞株HepG2,经RT PCR及免疫印迹等不同方法检测表明,被感染细胞能表达HCVNS3蛋白,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗HCV免疫应答能力的研究奠定了基础。; 李卫华赵连三周陶友何芳刘丽刘聪; 关键词：腺病毒丙型肝炎病毒 NS3 同源重组

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