杨斌
- 作品数：7 被引量：5H指数：1
- 供职机构：首都医科大学附属北京胸科医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市科技计划项目北京科技计划项目更多>>
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- 自身免疫性疾病患者PD-L1自身抗体的筛查
- 2017年
- 目的调查自身免疫性疾病和结核病患者PD—L1自身抗体产生情况。方法以重组人PD-L1蛋白为抗原，间接ELISA和免疫印迹法对血清样本进行测定，包括63例类风湿性关节炎（RA）、38例系统性红斑狼疮（SLE）、42例强直性脊柱炎（AS）、28例干燥综合征（ss）、50例结核病（TB）和60例健康人对照。结果ELISA结果显示，与健康人对照组（0．1317±0．0284，N=20）相比，RA（0．1996±0．0579，P〈0．0001）、SLE（0．1689±0．0338，P=0．0005）和AS组（0．1729±0．0619，P=0．0107）PD-LI自身抗体水平显著增高，而SS组（0．1341±0．0397，P=0．6834）无显著性差异。与健康人对照组（0．1541±0．0139，N=40）相比，结核病组（0．1709±0．1069，P=0．4215）PD—L1自身抗体水平无显著差异，但存在ELISA检测阳性个体，经免疫印迹证实存在PD—L1自身抗体。在46％RA、26％SLE、29％AS、1l％SS和12％TB中可检出PD-L1自身抗体，而健康人对照组未检出。结论自身免疫性疾病可检测到PD-L1自身抗体，此为进一步研究PD-L1与免疫相关疾病和免疫检查点调控机理奠定了基础。
- 闫卓红王小珏郑小芳易玲韦攀健贾红艳杨斌张洪涛
- 关键词：PD-L1自身抗体自身免疫性疾病免疫印迹
- 自身免疫性疾病患者PD-L1自身抗体的筛查
- 2016年
- 免疫检查点主要指免疫系统中存在的抑制性免疫调节信号,生理情况下一方面参与维持对自身抗原的免疫耐受,避免自身免疫性疾病,另一方面通过调节外周组织中免疫应答的持续性和强度避免组织损伤。细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）、程序性死亡受体-1（programmed death-1,PD1）及其配体 PD-L1（programmed cell death-ligand 1）是目前免疫检查点研究的热点分子,被认为是免疫调节的主要信号通路。自身抗体是免疫病理调节潜在的调控方式,国外研究主要聚焦于类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）,早期文献报道可以检测到CTLA-4自身抗体,近期报道了 RA患者中检出 PD-L1自身抗体。目前国内尚未见相关研究,在其他免疫关联性自身免疫疾病国内外均少有涉及,本研究筛查了多种自身免疫关联性疾病,以及免疫病理为基础的结核病患者PD-L1自身抗体存在状况,明确免疫检查点分子自身抗体调控方式的存在,为研究自身免疫病及免疫关联疾病发病机理、寻求新的治疗策略提供基础研究依据。
- 闫卓红王小珏郑小芳易玲韦攀健贾红艳杨斌张洪涛
- 关键词：自身免疫性疾病PD-L1自身抗体淋巴细胞抗原
- 全人源EGFR单抗的筛选和鉴定
- 2020年
- 目的:制备全人源表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体,为基于人EGFR靶点的肿瘤免疫调节治疗提供基础制剂。方法:采集110例胸部肿瘤(肺癌102例,乳腺癌8例)患者外周血,构建噬菌体单链抗体库。经噬菌体展示后筛选阳性克隆,测序并构建全长轻重链表达载体质粒,共转染HEK293。通过亲和层析获得纯化抗体,抗原抗体免疫反应测定抗体特异性和敏感性,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术测定抗体亲和力和流式细胞技术(fluorescence activating cell sorter,FACS)检测对肿瘤细胞系EGFR结合活性。结果:成功构建肺癌单链抗体噬菌体库,抗体库库容≥108,筛选获得两株单抗,分别为BTHG17-1,BTHG17-2,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定结合抗原敏感性为10 ng/mL,亲和力在10-8 mol/L水平,两抗体结合相同表位,可特异性结合野生型EGFR和突变体EGFRvⅢ蛋白,具有结合肺癌和神经胶质瘤细胞活性。结论:获得较高亲和力全人源EGFR单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),具有EGFR(包括EGFRVⅢ)特异性,为EGFR靶点封阻和免疫导向治疗研究提供一种新抗体工具。
- 李姝萍杨斌金鑫王小珏闫卓红易玲韦攀健王和林王和林张洪涛
- 关键词：肺癌噬菌体抗体库表皮生长因子受体人源抗体
- 红色荧光蛋白和荧光素酶双表达稳定肺癌细胞系的建立被引量：1
- 2018年
- 目的 构建能稳定表达红色荧光蛋白（RFP）和萤火虫荧光素酶（Fluc）的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础.方法 构建含Fluc和RFP基因的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,用获得病毒液感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,再用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,最后分别采用荧光显微镜和实时定量PCR检测稳定感染细胞中RFP和Fluc的表达.结果 成功构建了pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达Fluc和RFP的A549、H1975和K562细胞.荧光显微镜下可观测到3种稳定感染细胞中均有红色荧光.实时定量PCR检测结果显示,3种稳定感染细胞中Fluc基因的相对表达量远远高于对应的野生型细胞,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）.结论 获得的RFP和Fluc双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型的活体成像提供了新荧光配色细胞模型.
- 高鑫杨斌韦攀健王小珏张洪涛
- 关键词：红色荧光蛋白萤火虫荧光素酶慢病毒载体
- EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达被引量：1
- 2020年
- 目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。
- 李姝萍王小珏杨斌王和林王和林闫卓红易玲韦攀健郝建清张洪涛
- 一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达被引量：1
- 2018年
- 目的：制备特异性抗人表皮生长因子受体（EGFR）的单链抗体（sc Fv）,鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法：从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5’RACE技术扩增轻链和重链可变区（VL、VH）基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果：获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论：成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。
- 高鑫韦攀健闫卓红易玲王小珏杨斌张洪涛
- 关键词：表皮生长因子受体单链抗体
- miR-99a-5p在结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用被引量：2
- 2023年
- 目的:初步探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染THP-1细胞内特异miRNA在宿主抗结核免疫中的作用。方法:提取MTB感染及未感染THP-1细胞RNA,基于Illumina NovaSeq6000二代测序平台检测THP-1细胞内miRNA表达谱。采集4名健康受试者6 ml外周血并分离人原代巨噬细胞。应用实时荧光PCR(qRT-PCR)技术验证MTB感染THP-1细胞内特异miRNA并检测人原代巨噬细胞中靶标miRNA的表达水平。构建miRNA过表达载体,经慢病毒转染THP-1巨噬细胞获得稳定的过表达细胞株,使用qRT-PCR检测H37Rv感染的miRNA过表达细胞及对照空载体细胞中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)及γ-干扰素(IFN-γ)表达水平。结果:从16个二代测序结果表达差异明显的miRNA分子中选取既往未作研究且差异最为明显的miR-99a-5p(P=0.021)作为研究靶基因。通过qRT-PCR在THP-1细胞及原代巨噬细胞中验证,发现miR-99a-5p在THP-1感染组和原代巨噬细胞内的表达量(分别为0.482±0.148和0.433±0.072)均明显低于未感染组(1.536±0.290和1.113±0.218),差异均有统计学意义(t=6.476,P<0.001;t=3.167,P=0.019)。MTB感染miR-99a-5p过表达细胞后24 h的菌落形成单位(CFU)[64.0×10^(4)(52.0×10^(4),87.0×10^(4))]明显高于MTB感染的对照空载体细胞内CFU[17.0×10^(4)(16.0×10^(4),24.0×10^(4))],差异有统计学意义(Z=-2.323,P=0.029)。与MTB感染的对照空载体细胞相比,MTB感染的miR-99a-5p过表达细胞内TNF-α及IFN-γ的mRNA相对表达水平分别由1.018±0.310和1.687±0.135下降至0.740±0.001和0.631±0.374,差异均有统计学意义(t=4.631,P=0.010;t=3.349,P=0.010)。结论:miR-99a-5p可抑制TNF-α及IFN-γ的释放,促进MTB在巨噬细胞内的生长。MTB感染后宿主miR-99a-5p的下调表达可能在宿主抗结核感染免疫中发挥重要作用。
- 史雨婷董静贾红彦朱传智杨斌李自慧孙琦杜博平邢爱英张宗德潘丽萍
- 关键词：芯片分析技术微RNAS巨噬细胞
