目的建立一种快速的膜蛋白异源表达筛选方法,并验证重组蛋白细胞内定位及完整性。方法使用重叠PCR方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因与人CD81(h CD81)基因连接一起构成hCD81-GFP融合基因,重组基因克隆至pFastBac1载体上,使用昆虫细胞异源表达重组基因。通过观察绿色荧光信号判断重组蛋白的表达及定位。纯化重组蛋白,通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE分析重组蛋白的大小。结果使用hCD81上游引物和GFP下游引物进行PCR扩增获得hCD81-GFP融合基因,在1000和2000 bp DNA Marker旁有一条带与融合基因hCD81-GFP大小近似。融合基因插入pFastBac1质粒后测序证明,插入的融合基因序列正确。分子排阻色谱及SDS-PAGE分析显示,hCD81与绿色荧光蛋白融合表达。荧光信号显示重组蛋白定位到细胞膜上,与hCD81分子的细胞定位一致。分子排阻色谱结果显示,重组蛋白的洗脱峰成高斯分布,提示纯化的重组蛋白分子体积均一。依据hCD81-GFP融合蛋白的洗脱体积16.859 mL计算出的重组蛋白分子量为58.34×10^(3)Mr,与重组蛋白的理论分子量56.10×10^(3)Mr近似;洗脱液的SDS-PAGE分析显示,重组蛋白条带与66.2×10^(3)Mr蛋白Marker位置近似。结论目标蛋白与绿色荧光蛋白连接,通过观察荧光信号,仅需少量的细胞培养即可判断重组蛋白是否表达。该方法可以加快重组蛋白的表达筛选。
