张庆晓
- 作品数：10 被引量：13H指数：3
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- 发文基金：国家自然科学基金转基因生物新品种培育专项江苏省农业科技自主创新基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生化学工程更多>>
- 猪卵母细胞体外成熟及胚胎体外发育系统的优化
- 本研究通过优化猪卵母细胞体外成熟期间的激素添加方式及孤雌胚胎的激活方案，以期建立比较完善的猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育系统，并将其应用于转基因体细胞核移植胚胎的体外发育。
- 王慧利孟春花张庆晓李静心苏磊贺强朱前明曹少先
- 关键词：胚胎工程猪卵母细胞孤雌激活胚胎发育
- 人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达
- 2012年
- 采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。
- 苏磊曹少先丰秀静田石孟春花王慧利张庆晓王锋
- 关键词：基因克隆
- 猪卵母细胞体外发育系统的优化及转基因体细胞核移植系统的建立被引量：1
- 2012年
- 为改善猪卵母细胞体外发育系统,依次对卵母细胞体外成熟期激素处理、成熟后胚胎激活方式、激活后胚胎培养液选取进行优化,并将优化后系统应用于转基因体细胞核移植。结果显示,优化后的系统为:成熟前24.0 h添加10.0 IU/ml孕马血清促性腺激素(PMSG)和10.0 IU/ml人绒毛膜促性腺激素(hCG),激活方式为电脉冲(1.2 kV/cm,30μs)联合细胞松弛素B处理(5μg/ml,3.0 h),胚胎培养液为PZM3。在此系统下,卵母细胞成熟率达80.9%,卵裂率达92.8%,囊胚率达53.7%,将此系统应用于转EGFP基因胎儿成纤维细胞核移植,囊胚率达18.3%。以上结果表明,此系统可用于猪卵母细胞体外发育及转基因体细胞核移植。
- 王慧利孟春花张庆晓李静心苏磊贺强朱前明曹少先
- 关键词：卵母细胞体外发育体细胞核移植
- 人α-乳白蛋白转基因克隆奶山羊的获得与鉴定
- 引言目前,世界上已获得乳白蛋白转基因小鼠、大鼠、猪和牛等动物,但山羊上的研究较少。此外,随体细胞克隆技术的发展,已诞生多种克隆动物,但克隆效率总体偏低,克隆操作程序仍需进一步优化。本实验目的是优化体细胞克隆操作中的激活及...
- 王慧利孟春花张庆晓李静心贺强苏磊汪薇曹少先
- 文献传递
- 猪胚胎ZFN敲除技术体系的探索
- ZFN技术作为一种基因组修饰工具，具有高效、特异及适用性广泛的特点，近年来发展迅速，已成功应用于多种有机体及细胞类型的基因敲除。ZFN由一个非特异的FokⅠ核酸内切酶DNA切割结构域和一个特异性的DNA结合结构域构成。Z...
- 张庆晓
- 关键词：猪繁殖呼吸综合征核移植单细胞培养基因敲除转基因动物
- 电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化被引量：3
- 2012年
- 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响。结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著。不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率。质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8%。
- 张庆晓王慧利孟春花王锋曹少先
- 关键词：胎儿成纤维细胞电穿孔转染增强型绿色荧光蛋白
- 基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证
- 2014年
- 旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pEGFP-N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP-ATG。将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP-728。将pEGFP-728转入Hela细胞中,G418筛选Hela-728细胞系,转染ZFN到Hela-728,48h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明,通用载体pEGFP-ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP-728序列完全正确;pEGFP-728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela-728中,48h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选。
- 李静心王慧利孟春花张庆晓蒋进蒋进王婧
- 关键词：锌指核酸酶绿色荧光蛋白真核细胞
- 猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究被引量：5
- 2012年
- 通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),优化了PAM的纯化和冷冻保存方法,并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。结果表明:RPMI-1640培养液比DMEM培养液更适于PAM的培养和冷冻保存;巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明,贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度最高(P<0.05);用70%RPMI-1640+20%新生牛血清+10%DMSO的体系冷冻保存细胞密度为1×107个/mL的PAM可获得高达98.09%的存活率,冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P>0.05)。
- 孟春花曹少先苏磊贺强王慧利丰秀静张庆晓刘铁铮
- 关键词：肺泡巨噬细胞纯化冷冻保存
- 锌指核酸酶技术在基因组定点修饰中的应用被引量：4
- 2013年
- 锌指核酸酶已作为一种基因组编辑工具成功应用于多种有机体及细胞类型。它包括一个非特异的FokⅠ核酸内切酶DNA切割结构域和一个特异性的DNA结合结构域。可以在基因组定点产生双链断裂,并通过细胞对基因组DNA的自我修复途径使基因打靶效率提升几个数量级。当包含该位点同源区的外源DNA存在时发生同源重组修复,实现外源基因的定点敲入,无同源DNA存在时通过非同源末端连接途径产生基因突变。在锌指核酸酶技术出现前,基因打靶动物的生产主要是依靠ES细胞系上的同源重组技术或核移植基础上的克隆技术,但仅限于极少数物种。本文简要介绍这一技术作用原理和设计方法,以及它在疾病治疗,模式动物研究和动物生物反应器方面的最新研究进展,旨在展示锌指核酸酶技术的广阔前景。
- 张庆晓曹少先苏磊王慧利孟春花王锋
- 关键词：锌指核酸酶同源重组
- 基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证
- [目的]构建基于GFP 报告基因的ZFN 真核细胞筛选体系,为ZFN 的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法.[方法]以pEGFP-N1 为基础,去除EGFP 基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通...
- 李静心王慧利孟春花张庆晓蒋进王婧曹少先
- 关键词：锌指核酸酶绿色荧光蛋白真核细胞
