根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。用建立的LAMP方法对临床发病南美白对虾样品进行了检测,结果表明,LAMP方法适合对虾白斑综合征病毒的现场快速检测。
根据对虾桃拉综合征病毒(TSV)结构蛋白基因保守序列,利用Primer Explorer 4.0软件设计了4条引物,建立桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速(RT-LAMP)检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化;同时将建立的RT-LAMP检测方法与RT-PCR进行比较分析,RT-LAMP的检测灵敏度比RT-PCR高10倍。结果表明,RT-LAMP最适反应在60℃恒温条件60 min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果;RT-LAMP对感染TSV的对虾检测呈阳性,而对对虾其他常见病原检测均为阴性,具有高的特异性。
