刘丹
- 作品数：5 被引量：27H指数：2
- 供职机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：17
- 2011年
- 本研究旨在通过建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段。作者利用DNAStar软件对GenBank上发表的细粒棘球蚴EG95蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出高度亲水的优势表位区EG95s,对该区域编码基因进行克隆并表达。以纯化的重组融合蛋白为包被抗原,按常规方法建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA,并对各种条件进行优化。SDS-PAGE结果表明成功获得了可溶性好、表达效率高、纯化简便的重组融合蛋白GST-1EG95s和HIS-1EG95s,Western blot检测结果表明表达产物具有较好的反应原性。间接ELISA方法优化结果显示:HIS-1EG95s作为包被抗原效果优于GST-1EG95s。经统计学分析,确定间接ELISA方法的判定标准:OD450nm值≥0.235时判定为阳性,OD450nm值≤0.191时判定为阴性,介于二者之间则为可疑。分别对采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测,结果表明该方法与新西兰Wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%,阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应,批内变异系数介于3.8%～5.6%,批间变异系数介于5.7%～8.5%,结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。作者所建立的羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA检测方法有望为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段。
- 贾红刘丹侯绍华于琳琳柏丽华朱鸿飞
- 关键词：重组融合蛋白间接ELISA
- 非洲马瘟和西尼罗病毒的双重实时荧光MIRA检测引物探针组、试剂盒及方法
- 本发明公开了一种非洲马瘟和西尼罗病毒的双重实时荧光MIRA检测引物探针组、试剂盒及方法，AHSV和WNV引物与探针是针对各自病原所有种型的共有序列设计，可以鉴别出所有种型的AHSV与WNV。实验证明，本发明对于两种病原检...
- 沈青春丁家波钱佳豪蒋卉刘丹范学政张博源张广智冯宇
- 羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达被引量：2
- 2010年
- 本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。
- 于琳琳贾红侯绍华刘丹丁敏郭晓宇朱鸿飞
- 关键词：包虫病重组杆状病毒
- 细粒棘球蚴Eg95s基因的串联表达及表达系统优化被引量：9
- 2009年
- 为研制新型棘球蚴病基因工程疫苗,根据GenBank公布的细粒棘球蚴Eg95基因序列,针对其中一段348 bp高度亲水的优势表位序列设计引物,扩增Eg95s基因,利用同尾酶法基因同向串联方案,获得3拷贝Eg95s串联体。分别用两种表达载体pGEX-6p-1和pET-32a构建重组质粒,转化入3种大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、Rosseta(DE3)和Origami(DE3),对其进行IPTG诱导表达,经免疫印迹分析结果表明,均能正确表达具有免疫原性的Eg95s蛋白。通过重组蛋白的表达量、可溶性、纯化方法等方面的比较,对Eg95s重组表达系统的载体及宿主菌进行了优化,结果表明,3拷贝的串联Eg95s在以pET-32a为表达载体,Rosseta(DE3)为宿主菌的系统中表达最佳。最终获得了表达量高、可溶性好、纯化方便的Eg95s重组蛋白表达系统,为大规模生产棘球蚴病基因工程疫苗提供了科学依据。
- 刘丹贾红侯绍华丁敏朱鸿飞
- 非洲马瘟和西尼罗病毒的双重实时荧光MIRA检测引物探针组、试剂盒及方法
- 本发明公开了一种非洲马瘟和西尼罗病毒的双重实时荧光MIRA检测引物探针组、试剂盒及方法，AHSV和WNV引物与探针是针对各自病原所有种型的共有序列设计，可以鉴别出所有种型的AHSV与WNV。实验证明，本发明对于两种病原检...
- 沈青春丁家波钱佳豪蒋卉刘丹范学政张博源张广智冯宇
