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靶向表皮生长因子受体的肽抑制人皮肤鳞状癌A431细胞增殖、发展的研究: 目的:靶向表皮生长因子受体的肽(TE)抑制人皮肤鳞状癌A431细胞生长的作用。方法:用不同浓度的TE处理A431细胞,通过CCK8法检测细胞活性,计算IC50值即TE作用的最适浓度,以人乳腺癌MCF-7细胞及人黑素瘤细胞...; 程开

MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用被引量：3: 2017年; 目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性。结果:成功构建重组质粒pET21a(+)/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白。SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48 k Da,与预期蛋白大小一致,并以His单抗进行Western blot鉴定,出现了特异性的单一条带。MAGEA3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Western blot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单一条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375(黑色素瘤细胞株)和SGC-7901细胞(胃癌细胞株)的胞浆内出现荧光团块。表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白。结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆Ig G抗体效价可达1:40 000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白。结论:通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原。; 蔡一奇程开陈旭东陈孝冬岑丹维张婵琼宋易玲毛姗姗叶晓鲜张丽芳朱冠保; 关键词：原核表达系统多克隆抗体胃肿瘤

PD-L2蛋白B细胞表位预测及其与PD-1结合的三维结构分析: 2018年; 目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和Jameson-Wolf抗原指数以及Emini表面可及性方案等,预测结果被用以对PD-L2的优势B细胞表位区段进行多方面分析。运用抗原指数分析,预测PD-L2的B细胞表位。使用BLAST分析人源PD-L2与小鼠PD-L2的同源性,将人源PD-L2的B表位与小鼠PD-L2的序列进行匹配。将与人源PD-L2表位匹配的序列在小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合模型上定位,对其立体结构进行模拟,进一步直观地分析B细胞表位与蛋白结合位点的关系。结果:PD-L2的全长氨基酸序列共含有273个氨基酸,相对分子质量为31 k Da的可溶性蛋白;经综合分析,其B细胞优势表位可能为氨基酸序列N端的60~72、93~97、133~139、164~171区段。模拟立体结构分析显示表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PDL2的结合区域内。结论:利用生物信息学预测发现PD-L2的优势B细胞表位中,60~72、93~97、133~139、164~171区段为PD-L2的B细胞表位,其中表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PD-L2的结合区域内。可为PD-L2抗体设计和研究提供理论基础。; 程开陈旭东吕开绩金劲激叶晓鲜张丽芳朱冠保; 关键词：B细胞表位

肿瘤/睾丸抗原MAGE-A3多克隆抗体的制备及其在人黑素瘤细胞检测中的应用: 目的:通过原核表达系统制备人肿瘤/睾丸抗原MAGE-A3蛋白,并制备其多克隆抗体,后进行初步鉴定和应用。方法:使用分子克隆和原核表达系统制备MAGE-A3蛋白;鉴定后使用MAGE-A3蛋白免疫兔制备其兔多克隆血清抗体,用...; 程开

程序性死亡受体配体-1 B细胞表位预测与分析被引量：4: 2018年; 目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等,结合PD-L1的二级结构与其柔性区域对PD-L1的优势B细胞表位区段进行综合分析,建立3D模型,结合功能定位,进一步运用抗原指数分析预测,将人与小鼠的B细胞表位进行对比分析,并与多种实验动物进行同源性分析。结果:人和小鼠的PD-L1均为一型跨膜蛋白,均由290个氨基酸残基组成,相对分子质量均为33 kDa。人和小鼠PD-L1的胞外段分别位于N端的19~238和19~239。经综合分析,与PD-1、PDL1结合相关的人和小鼠的B细胞优势表位可能分别位于其氨基酸序列N端的41~46、60~63、71~75和40~48、58~63、72~88区段,即KFPVEK、EDKN、EEDLK和RFPVERELDL、EKEDE、EDLKPQH肽段;同源性分析显示包含本研究所预测的表位的氨基酸序列在多种动物之间高度保守。结论:将生物信息学预测B细胞表位的方法与3D模型建立及功能定位的方法相结合,筛选出人和鼠各3条与PD-L1功能区相近的优势B表位,为阻断PD-1和PD-L1结合的拮抗剂的研究提供了理论基础。; 陈旭东程开吕开绩张丽芳朱冠保; 关键词：B细胞表位肿瘤免疫疗法

小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性被引量：1: 2018年; 目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核表达系统制备相应的重组蛋白并纯化,通过Western blot进行鉴定;将纯化的mPD-L1蛋白免疫健康日本大耳白兔制备兔多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot分析得到的多克隆抗体的效价和特异性,并且将该多克隆抗体作为免疫荧光的阳性对照。最后应用ELISA和免疫荧光验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的亲和性。结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示原核表达的重组蛋白与预期大小一致,mPD-L1和mPD-1分别为25 kDa和40 kDa。经mPD-L1蛋白免疫后的日本大耳白兔能够产生特异性抗体,抗体效价在免疫后第6周达到高峰,Western blot检测结果显示多克隆血清可特异性识别mPD-1。ELISA结果表明,原核表达的mPD-L1蛋白能够和mPD-1蛋白结合,实验组OD450值明显高于对照组。免疫荧光结果显示,在小鼠PD-L1阳性细胞B16(小鼠黑色素瘤细胞株)的胞膜区出现绿色荧光团块。结论:利用原核细胞表达并纯化后获得mPD-L1和mPD-1蛋白,并在体外成功验证了mPD-L1和mPD-1之间的结合特性,为后期利用mPD-1和PD-L1的生物学特性研究提供了基础。; 吕开绩陈旭东程开王路得朱进顺Kamara Saidu张丽芳朱冠保; 关键词：原核表达免疫荧光小鼠

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程开

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