王亚楠
- 作品数：4 被引量：0H指数：0
- 供职机构：沈阳农业大学生物科学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- MDM2与端粒保护蛋白1的相互作用及其功能
- 2014年
- 目的:探究鼠双微体2同源体(MDM2)与端粒保护蛋白1(POT1)在细胞水平是否有相互作用,及其是否发挥E3泛素化连接酶的功能。方法:首先,用蛋白酶体抑制剂MG132处理稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达情况;其次,在HeLa细胞中转入外源的Myc-MDM2和Flag-POT1质粒,48 h后收集细胞,通过免疫共沉淀方法验证Myc-MDM2和Flag-POT1是否具有相互作用;再次,在稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞中转入Myc-MDM2或MDM2 siRNA,48 h后收集细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达水平。结果:MG132处理后,Flag-POT1的表达量明显升高且有拖尾现象,免疫共沉淀显示Myc-MDM2和Flag-POT1具有相互作用,但无论转入Myc-MDM2还是MDM2 siRNA,Flag-POT1的表达水平没有明显变化。结论:POT1通过泛素化途径降解,MDM2与POT1具有相互作用,但MDM2不是POT1主要的E3泛素化连接酶。
- 王亚楠金蕊马世良黄君健
- 关键词：HELA细胞免疫共沉淀
- 核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
- 2014年
- 目的:构建高效抑制核磷蛋白NPM1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰载体。方法:以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体pll3.7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其与慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HT1080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果:酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HT1080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPM1的表达显著降低。结论:构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPM1的表达,为NPM1功能的研究提供了有力工具。
- 王亚楠金蕊张宪马世良黄君健
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体
- Pot1通过泛素化修饰影响自身的稳定性
- 2015年
- 目的：研究Pot1蛋白的稳定性。方法：利用慢病毒表达载体构建表达外源Flag-Pot1的HeLa细胞稳定克隆，在该克隆中加入CHX抑制新蛋白的合成，检测外源Pot1的半衰期，确定Pot1的稳定性；将Pot1质粒与Ub质粒共转293T细胞后，加入MG132阻止蛋白酶体途径，确定Pot1的稳定性是否受泛素化修饰的影响；构建点突变和截短突变的Pot1质粒，与Ub质粒共转293T细胞后，加入MG132阻止蛋白酶体途径，确定影响Pot1稳定性的区域。结果与结论：Pot1通过泛素化修饰影响自身稳定性；点突变和截断突变实验证实Pot1存在多个泛素化位点，且主要发生在C端400-634位氨基酸残基。
- 杨丹丹金蕊张金丁王亚楠黄君健魏道智
- 关键词：稳定性泛素化
- TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定
- 2014年
- 目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。
- 张金丁金蕊杨丹丹王亚楠黄君健苏金为
- 关键词：SHRNA干扰WESTERN印迹免疫荧光
