刘玉斌
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 供职机构：军事医学科学院放射与辐射医学研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生理学更多>>
- HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量被引量：1
- 2017年
- 目的建立HPLC技术定量测定发酵上清液中重组新蛭素(EH)含量的方法,用于监测发酵过程中EH的表达量变化与诱导时间的关系,使EH产量最大化。方法利用HPLC技术建立EH的检测方法,通过对该方法的灵敏度、精密度和加标回收率实验的考察,确立该方法的可行性;利用该方法对EH样品进行稳定性考察,并对酵母发酵上清液进行跟踪检测。实现了对发酵过程中发酵上清液中EH的实时监测。结果 EH在214 nm处有较强的特异性吸收峰,其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系,r^2=0.9995,EH线性浓度范围在0.012~4.8 mg/ml。该测定方法具有很好的精密度,样品多次重复测定的RSD值为1.4227%;加标回收率在95%~98%。应用该方法对EH样品的稳定性测定结果显示,样品4℃保存稳定性较好,24 h内样品主峰面积百分比>95%,在20℃条件下,8 h内样品稳定性良好,主峰面积百分比>95%。该方法准确度高、重复性好,进行测定时,可根据EH的特异吸收峰,对发酵过程中发酵上清液中EH含量进行实时定量测定。测定结果显示,在一定时间范围内,EH的表达量与诱导时间成正相关。结论本研究建立了HPLC技术检测EH含量的方法,该方法可用于发酵过程中EH的实时定量监测,使EH的产量达到最大值,为EH的临床样品制备提供有力支持。
- 刘玉斌刘玉斌于爱平吴祖泽吴祖泽
- 关键词：酵母表达系统高效液相色谱实时监测
- 大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺
- 2016年
- 为建立可产业化的大肠杆菌表达的重组新蛭素(neorudin,EH)生产工艺,主要采取从低密度到高密度发酵的优化思路,优化了发酵罐培养基和诱导时间;比较了超声破碎和反复冻融的目的蛋白提取方法;纯化工艺采用离子交换层析2步法进行:SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Source 15Q阴离子交换层析;所得产品用免疫印迹法鉴定,经HPLC检测纯度,凝块法检测抗凝比活性;最后对纯化产品进行结构确证,包括高分辨率质谱、C-末端测序、N-末端测序、二硫键分析.结果显示:优化后的发酵工艺确定基于TB培养基的高密度发酵工艺,菌体OD_(600)可达40左右,每升菌体湿质量可达70 g左右,目的蛋白表达量约400 mg/L;菌体反复冻融离心上清经过纯化获得的目的蛋白HPLC纯度均大于97%,纯化收率为26.12%,抗凝比活性为1 024 ATU/mg,用高分辨率质谱检测其分子质量约为7 415.188 0 ku,N-末端、C-末端和二硫键均与理论相符.建立了EH在大肠杆菌中的高密度发酵和纯化工艺.
- 吴祖泽郭莹莹刘玉斌郭彦梅董俏言靳继德姚敏于爱平
- 关键词：大肠杆菌高密度发酵离子交换层析抗凝活性
- EH-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析
- 2017年
- 目的:为延长重组新蛭素(EH)的半衰期,制备通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1Fc的融合蛋白EH-LFc,并对其进行功能分析。方法:采用重叠PCR技术构建Eh-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pcDNA3.1,用脂质体将重组表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,G418抗性筛选稳定克隆株;Western印迹检测培养上清中EH-LFc蛋白的表达,用有限稀释法对G418抗性筛选出的混合克隆单克隆化,通过Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,Lowry法检测蛋白浓度,SDS-PAGE、HPLC法检测目的蛋白纯度,质谱法分析相对分子质量,凝血因子Ⅹa裂解融合蛋白后采用纤维蛋白凝块法测定其抗凝活性。结果:构建了重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc,并获得稳定表达EHL-Fc的细胞株。表达产物的相对分子质量为72 168,HPLC检测亲和层析获得的EH-L-Fc纯度达93.9%。完整的EH-L-Fc无抗凝活性,经凝血因子Ⅹa裂解后其抗凝比活性为96.6 ATU/mg。结论:获得稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株和较高纯度的重组融合蛋白,且该重组融合蛋白经凝血因子Ⅹa裂解后可释放抗凝活性。EH-L-Fc融合蛋白的获得为研究新蛭素的长效剂型奠定了重要基础。
- 庞玉红刘玉斌于爱平吕英涛
- 关键词：抗凝FC融合蛋白
