彭智勇
- 作品数：2 被引量：6H指数：1
- 供职机构：广州军区广州总医院更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 小干扰RNA抑制HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制与表达被引量：5
- 2008年
- 目的了解基于载体的siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用,观察特异性siRNA载体对细胞的毒副作用及可能的非靶向效应,探讨新的抗病毒治疗手段。方法根据GenBank收录HepG2.2.15细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV的C基因区的3条siRNA的双链复合体,经退火连接入p-Silencer-Cmv4.1载体,连接产物转化JM109细胞,载体经聚丙烯酰胺凝胶电泳及测序鉴定后中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1转染HepG2.2.15细胞。免疫荧光及Western blot检测病毒蛋白HBsAg、HBeAg的表达;RT-PCR检测HBV RNA的表达变化;Real-time PCR定量检测HBV DNA拷贝变化。同时采用MTT法检测细胞的生长曲线与生长率。ELISA法检测IFN-α的表达变化。结果Western Blot结果显示在转染第3天p-C2对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(81.15±0.69)%、(88.12±0.92)%,免疫荧光显示同样结果。RT-PCR检测结果显示C基因特异的表达性siRNA可以显著抑制HBV的mRNA表达,对C区HBV mRNA的抑制达96.9%。定量PCR检测显示特异性siRNA使HBV DNA拷贝数降低102个数量级。而MTT检测表明该特异性siRNA表达载体不影响细胞的生长曲线与生长率,治疗组与对照组比较无差异。ELISA法检测表明特异性siRNA并不影响细胞干扰素的表达,p-C1、p-C2、p-C3组与未转染组、p-NC组比较表达均无差异。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达。该抑制作用是特异性的,同时对细胞无明显毒副作用。该作用为基因水平的裂解作用,不会出现耐药现象。
- 任广立方颖张卫云马恒颢许蔓春欧巧群罗爱武王鲜艳彭智勇白雪帆
- 关键词：乙型肝炎病毒小干扰RNA基因治疗HEPG2.2.15细胞
- 乙型肝炎病毒特异性小干扰RNA对转基因小鼠毒副作用的评价被引量：1
- 2010年
- 目的探讨基于载体的表达性小干扰RNA(siRNA)对乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠的毒副作用。方法 siRNA表达载体经微静脉注射转染HBV转基因小鼠,设立特异性siRNA组、PBS对照组、阴性质粒对照组及正常Balb/c小鼠对照组。在注射后5 d、12 d、19 d、26 d、33 d、2个月和3个月的不同时间,经其内眦静脉采血检测小鼠ALT水平变化。ELISA方法检测其血清干扰素-α(IFN-α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。W estern blot检测其肝脏组织中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、原癌基因(c-Fos)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达变化。采用TUNEL染色检测细胞凋亡,HE染色进行组织病理学观察。结果基于聚合酶Ⅲ(PolⅢ)的siRNA表达载体与基于聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的siRNA表达载体相比,长期作用机体可使转基因小鼠血清ALT水平显著升高(P<0.05);ELISA分析发现IFN-α水平前者似乎高于后者,但差异无统计学意义(P>0.05)。在治疗26 d,直到治疗3个月,特异性siRNA治疗组与PBS对照组相比,TNF-α表达在PolⅢ组表达明显降低(P<0.05);而PolⅡ组TNF-α表达与PBS对照组比较差异无统计学意义。W estern blot结果表明肝组织Bcl-2、c-Fos表达显著增加,而Bax表达明显降低(P<0.05),且该组凋亡分析表明细胞凋亡被明显抑制。组织形态学可见肝细胞出现二倍体,核仁增大,核膜清晰可见。结论基于PolⅢ的siRNA表达载体与PolⅡ的siRNA表达载体相比对肝细胞有一定的毒副作用,凋亡被抑制,细胞增殖失控。过强表达的HBV特异性siRNA可影响机体的生物网络调控,导致增殖与凋亡的失衡。
- 任广立方颖马恒颢张卫云王鲜艳许蔓春彭智勇赵树进
- 关键词：乙型肝炎病毒基因治疗小干扰RNA毒副作用
