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杨侃侃: 作品数：20 被引量：74H指数：6; 供职机构：安徽农业大学动物科技学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金安徽省自然科学基金国家级大学生创新创业训练计划更多>>; 相关领域：农业科学更多>>

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口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位被引量：4: 2017年; 为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。; 殷冬冬杨侃侃白彩霞赵玉洁潘飞徐燕华梅跃辉苏莉钟灵毓崔佣楸张子军祁克宗王桂军王勇; 关键词：VEGF基因原核表达亚细胞定位

羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位被引量：2: 2018年; 目的克隆表达羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析。方法根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增。将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024。将原核重组质粒转化Rosetta (DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况。纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析。将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta (DE3)细胞中正确表达,大小为59kDa。Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达。结论本实验为后续深入研究ORFV 024基因功能和致病机制奠定了基础。; 苏莉俞赵荣杨侃侃王元红钟灵毓崔佣楸张高峰张谦王勇李永东; 关键词：羊口疮病毒多克隆抗体亚细胞定位

羊口疮病毒安徽株VIR基因克隆与生物信息学分析被引量：3: 2018年; 目的获取并分析ORFV AH-F10株VIR基因序列及预测其编码蛋白的生物信息学特点。方法利用实验室保存的羊口疮AH-F10株,设计VIR基因引物并进行PCR扩增、克隆及序列测定,同时利用生物信息学方法对其编码的蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域以及线性细胞表位进行预测。结果 AH-F10-VIR基因长552 bp,编码183个氨基酸,与Nantou株的VIR基因同源性最高,核苷酸同源性高达99.6%,氨基酸同源性为100.0%。生物信息学分析结果显示编码的蛋白相对分子量为19.88 kDa,等电点为4.83,为亲水性蛋白;α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链分别占36.07%、3.83%、43.17%和16.94%;三级结构预测显示VIR蛋白存在较多的α-螺旋与无规则卷曲,同二级结构预测结果相符;含有17个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构区域,有15个潜在的B细胞优势表位,4个CTL细胞表位以及5个Th细胞表位。结论成功克隆了羊口疮安徽株VIR基因并预测了VIR蛋白的生物信息学相关信息,为进一步研究VIR蛋白奠定了基础。; 杨侃侃俞赵荣张谦张高峰王元红张学琪鲁智敏刘自敏彭开松王勇李永东; 关键词：羊口疮病毒克隆生物信息学分析

口疮病毒020基因的克隆、表达及多抗制备被引量：6: 2017年; 羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。; 王勇赵玉洁杨侃侃殷冬冬白彩霞潘飞梅跃辉颜秀梅王君徐前明蒋书东; 关键词：羊口疮病毒克隆原核表达多克隆抗体

1株番鸭源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力基因分析被引量：9: 2020年; 为查清引起滁州地区某养殖场雏番鸭死亡原因,本研究通过对分离细菌的鉴定和动物致病性试验,确定奇异变形杆菌是引起此次雏番鸭发病的病原体,并将分离的奇异变形杆菌命名为AHcz-1株.根据其16S rRNA基因序列,建立其遗传进化树;根据已报道的8个毒力基因ureC、zapA、mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、atfC序列,设计引物进行PCR扩增,并对毒力基因进行序列分析.结果显示:AHcz-1株与日本株(AB932526.1)亲缘关系最近,同源性高达100%;毒力基因pmfA、atfA、ureC均未发生变异;AHcz-1株具有较强的致病性;致病菌对丁胺卡那高度敏感,对庆大霉素、恩诺沙星中度敏感,对其它17种抗生素不敏感,表明AHcz-1株具有多重耐药性.本研究为番鸭源奇异变形杆菌临床诊断、临床用药及遗传变异研究奠定了基础.; 俞赵荣杨侃侃王元红张谦苏莉鲁智敏张学琪刘自敏李传峰刘光清王勇李永东; 关键词：番鸭奇异变形杆菌毒力基因

鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：11: 2020年; 为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。; 白彩霞张达赵靓杨侃侃王小朋李新路李锦春李永东王勇; 关键词：SYBR

绿茶粉改善免疫应激小鼠肠道屏障的作用机制被引量：3: 2019年; 为探究绿茶粉改善免疫应激小鼠肠道屏障功能的作用机制。选取72只三周龄SPF级C57BL/6雄鼠,对其适应性喂养3 d后随机分成Ⅰ组(阴性对照)、Ⅱ组(阳性对照)、Ⅲ组(添加抗生素)、Ⅳ组(添加1%绿茶粉+茶多酚)、Ⅴ组(添加2%绿茶粉+茶多酚)和Ⅵ组(添加3%绿茶粉+茶多酚),每组3个重复,每个重复4只。在小鼠45 d时,Ⅰ组腹腔注射生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组按10μL/g的剂量腹腔注射大肠杆菌脂多糖。注射5 h后采集血液及组织器官。采用RT-PCR测定肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量;ELISA法测定血清中IgA、IgG、IgM、肠道sIgA和血浆内毒素含量。结果表明,与Ⅱ组相比,添加茶多酚的绿茶粉能显著降低小鼠血浆内毒素的含量,促进血清中IgA、IgG、IgM和肠道sIgA分泌,同时增加肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量。本研究表明,绿茶粉可以通过促进肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量,修复肠道屏障,增强免疫应激小鼠的体液免疫,从而减轻肠道炎症,达到保护肠道的作用。; 王元红白彩霞杨侃侃张雨晨俞赵荣王勇蔡海莹; 关键词：绿茶粉肠道屏障免疫应激小鼠

羊口疮病毒127基因的克隆表达及亚细胞定位分析: 2019年; 为了对羊口疮病毒(ORFV)AH-F10株127基因进行原核表达及亚细胞定位,本试验采用PCR方法扩增出ORFV127基因,成功构建原核表达重组质粒pGEX-6p-1-ORFV127和真核重组质粒pEGFP-N1-ORFV127。将原核表达重组质粒转化到大肠埃希氏菌中表达,并进行纯化和鉴定。以纯化的蛋白质免疫BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,利用Western-blot技术鉴定其反应原性。利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-N1-ORFV127转染至Vero细胞,通过倒置荧光显微镜观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果表明,获得的ORFV127基因序列全长为558bp,ORFV127蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,主要以包涵体蛋白质的形式表达,大小约49000。Western-blot结果显示,免疫小鼠获得的抗ORFV127蛋白的多克隆抗体可特异性识别ORFV127蛋白,倒置荧光显微镜观察发现,ORFV127蛋白主要定位于细胞质。本试验结果为后续研究ORFV127蛋白的功能提供了宝贵的生物材料。; 钟灵毓王元红白彩霞杨侃侃俞赵荣鲁智敏张学琪刘自敏蒋书东李永东王勇; 关键词：羊口疮病毒原核表达亚细胞定位

羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析被引量：10: 2019年; 试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27. 57%,延伸链(e)占17. 28%,β-转角(t)占12. 13%,无规则卷曲(c)占43. 01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。; 张高峰杨侃侃张谦王元红俞赵荣张学琪鲁智敏刘自敏李永东王勇; 关键词：克隆表达生物信息学

表达羊口疮病毒B2L基因重组腺病毒的构建及鉴定被引量：4: 2017年; 为构建表达羊口疮病毒(ORFV)B2L基因的重组腺病毒,提取实验室保存的ORFV AH-F10临床分离株的病毒核酸,PCR扩增B2L基因,将其克隆至穿梭载体中,再将重组穿梭质粒pHBAd-ORFV-B2L与骨架载体质粒pHBAdBHGloxΔE1利用脂质体共转染HEK293细胞,转染后48h收获包装成功的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L,对rAdORFV-B2L进行病毒滴度测定及遗传稳定性鉴定。结果表明:构建获得的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L病毒滴度达到107.9 TCID50·μL^(-1)。Western-blot检测结果表明rAd-ORFV-B2L在体外能够表达B2L蛋白,且能够与ORFV多抗血清发生特异性反应。RT-PCR检测结果表明,连续传代的rAd-ORFV-B2L能够稳定表达外源蛋白B2L。该研究为后续腺病毒疫苗的动物保护试验奠定基础。; 王勇杨侃侃王元红俞赵荣潘飞崔佣楸苏莉钟灵毓徐前明蒋书东李永东; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因重组腺病毒

杨侃侃

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