李文新
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
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- 可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达、纯化及生物学活性鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的:对鼠白细胞介素15受体α亚单位(IL-15Rα)的胞外区段,即可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)进行原核表达及纯化,并测定其配体结合能力及相应生物学功能。方法:采用RT-PCR方法,以鼠脾脏细胞总RNA为模板扩增编码sIL-15Rα的基因片段,经测序确证后与原核表达载体pQE-30连接,所得重组表达质粒pQE-30/sIL-15Rα转化E.coli M15构建表达重组子。通过降低诱导温度和IPTG浓度的方式实现重组蛋白的可溶性表达,金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,并经SDS-PAGE和Western blot验证。采用固相受体结合分析法测定重组蛋白与IL-15间的亲和力,并以CTLL-2细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功构建了重组表达质粒pQE-30/sIL-15Rα,并在25℃、0.5mmol/LIPTG条件下实现了重组蛋白的可溶性表达。所得重组蛋白的相对分子量约为29 kD,纯度大于95%,与IL-15之间的亲和力为4.9×10-11mol/L,具有显著的协同IL-15促CTLL-2细胞增殖效应。结论:获得了功能性的重组蛋白sIL-15Rα,为深入系统地研究IL-15Rα的独特生物学性状,以及开展IL-15靶向性的研究工作奠定了基础。
- 李文新范俊杨润琳蔡刚明蒋孟军曹国宪罗世能
- 关键词：蛋白纯化生物学活性
- IL-15R α生物协同作用的体外细胞学评价
- 2008年
- 目的在细胞水平对IL-15R α的生物协同效应进行观察和评价。方法以IL-15敏感细胞株CTLL-2为靶细胞,采用MTT法检测细胞的活性及增殖情况,在摸清CTLL-2细胞增殖同IL-15之间的剂量依赖关系的基础上,分别在中、低剂量上观察经倍比稀释后的IL-15R α对IL-15体外细胞学活性的影响,其间还分别观察了IL-15R α单独作用以及IL-15R α和IL-15特异性抗体介入对CTLL-2细胞增殖的影响。结果CTLL-2细胞增殖同IL-15之间有着显著的剂量依赖关系;在50ng/mL的IL-15适中浓度下,1ng/mL的IL-15R α可以显著促进靶细胞的增殖(0.270±0.008vs.0.593±0.026,P<0.05);10ng/mL的IL-15临界浓度下,同样浓度的IL-15R α可使靶细胞产生近100倍的增殖(0.005±0.017vs.0.498±0.060,P<0.05);10ng/mL和50ng/mL的IL-15浓度下,IL-15R α发挥最大生物协同效应的浓度分别为7.81ng/mL和15.63ng/mL;单独IL-15R α没有促靶细胞的增殖效应,抗IL-15和IL-15R α的特异性抗体可有效阻断IL-15/IL-15Rα之间的协同作用。结论IL-15R α能够特异地通过IL-15发挥生物协同效应,该效应在低IL-15浓度下表现得尤为明显,IL-15/IL-15R α间适宜的配伍比例是确保该协同效应最大程度发挥的关键。
- 范俊杨润琳蒋孟军曹国宪李文新
- 关键词：IL-15
- 小鼠甲状腺细胞的原代培养及其摄碘功能研究被引量：3
- 2008年
- 目的建立小鼠甲状腺细胞的原代培养方法,并研究其体外摄碘功能,为甲状腺功能的体外研究奠定基础。方法取小鼠甲状腺组织,去筋膜和结缔组织,剪碎后用1mg/mL的胶原酶于37℃消化2h,其间间歇振荡数次,1,200g离心收集细胞沉淀,Ficoll分离得甲状腺单个核细胞,灭菌PBS洗涤细胞2遍,用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至2×105/mL,24孔板常规接种培养,以"半量换液法"连续培养数天。用抗甲状腺球蛋白抗体为识别抗体的间接免疫荧光法检测原代培养细胞甲状腺球蛋白的表达状况。体外摄碘试验于每孔加入0.1μCi125I后继续培养2h,用冰冷的PBS洗涤细胞数遍,裂解细胞并进行蛋白浓度测定及放射性计数。温度及竞争物阻断试验分别在0℃～4℃和加入100mmol/L NaClO4的条件下进行。结果采用上述方法获得的小鼠甲状腺原代培养细胞在体外可形成甲状腺细胞所特有的"次级滤泡样"结构。免疫荧光检测结果显示,细胞上有甲状腺细胞特有的甲状腺球蛋白的表达。体外摄碘试验结果显示,用该方法培养的甲状腺细胞具备良好的摄碘功能,该功能具有对温度和高氯酸盐的双重敏感性。结论建立了简便可行的小鼠甲状腺细胞的原代培养方法,为开展甲状腺细胞的摄碘及其他相关功能的研究奠定了基础。
- 范俊杨润琳邹美芬曹国宪李文新
- 关键词：小鼠甲状腺甲状腺细胞原代培养碘
- 小鼠白细胞介素-15与其受体α亚单位协同作用的初步研究
- 2010年
- 目的原核表达小鼠白细胞介素-15（mouse interleukin 15，mlL-15），并初步研究其与受体α亚单位（mlL-15R α）的协同效应。方法从小鼠肾脏组织克隆mlL-15成熟从部分的基因片段，并亚克隆至原核表达载体pQE-30，所得重组表达质粒pQE-30/mlL-15转化EcoliM15。得到的转化子经IPTG诱导后获得重组表达产物，并进行SDS-PAGE和Western Blot检测。Ni-NTA亲和层析柱上纯化、复性重组蛋白，以获得成熟的mlL-15。采用MTT法检测重组mIL-15促CTLL-2细胞增殖的生物学活性，并进一步研究，mlL-15与mlL-15Rd结合后协同促进靶细胞增殖的功能。结果重组mlL-15丰要以包涵体形式存在，其相对分子质最约为14ku，并能为抗His和抗mlL-15抗体昕特异性识别。经Ni-NTA柱上蛋白纯化、包涵体复性后，可得到纯度约为95％的成熟蛋白。成熟mlL-15能够促进CTLL-2细胞增殖，并具有明显的屋效关系；并且，在mIL-15Rα的配合下，mlL-15的促CTLL-2细胞增殖的活性冠著增强，尤其足在低mIL-15浓度条件下该协同作用表现得愈发明显。结论获得了具有牛物活性重组mlL-15，并初步研究了其与mlL-15Ra组成复合物的体外协同效应。该研究成果为进一步研究lL-15及IL-15Rd协同性的作用机理和开展小鼠成体免疫治疗研究奠定了基础。
- 杨润琳范俊罗世能李文新
- 关键词：IL-15蛋白纯化包涵体复性
