张跃灵
- 作品数：11 被引量：11H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 提高表达分选酶A的猪链球菌突变株的构建及初步评价
- 2021年
- 为了提高猪链球菌(Streptococcus suis,SS)05ZYH33菌株中分选酶A(SrtA)的表达量,本研究利用同源重组技术,将强启动子Peno、SrtA基因与红霉素抗性基因融合并转化05ZYH33野生菌株(05ZYH33-WT),构建SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,并对05ZYH33-srtAe突变株和05ZYH33-WT进行生长特性分析和SrtA蛋白的western blot检测;进一步构建SS SrtA基因缺失株05ZYH33-srtA^(Δ)作为对照,通过检测05ZYH33-WT、05ZYH33-srtAe和05ZYH33-srtAΔ菌株表面蛋白SSU05_0630的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活性,初步评价SrtA的提高表达在SS表面蛋白锚定中的作用。Western blot结果显示,正确构建了SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,且该菌株的生长速度和05ZYH33-WT基本相同,但SrtA的表达量却提高了2.4倍。菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性检测结果显示,05ZYH33-srtA^(Δ)菌株的NAG活性和本实验室前期构建的SSU05_0630基因缺失株ssu05_0630^(Δ)相同,检测不到SSU05_0630蛋白的NAG活性,表明SSU05_0630蛋白是SrtA的底物,通过SrtA锚定到SS的表面。05ZYH33-srtAe和05ZYH33-WT菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性无明显差异,即SrtA表达量的提高并没有提高SSU05_0630蛋白在SS表面的锚定量。本研究首次构建了提高SS SrtA表达量的突变株,并对SrtA表达量的提高是否对SS表面蛋白锚定产生影响进行了初步探究,为进一步研究SrtA表达量的提高对SS其他表面蛋白锚定量的影响,以及优化SS表面蛋白展示系统奠定了基础。
- 朱金鲁陈平黄萌萌刘冉卫东刘思国张跃灵
- 关键词：猪链球菌强启动子
- 利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株被引量：4
- 2019年
- 为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_(tufA-cre)质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。
- 刘冉陈福广陈平黄萌萌朱金鲁谢芳孟庆文刘思国刘建华张跃灵
- 关键词：猪链球菌CRE/LOXP系统基因缺失
- 猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究被引量：2
- 2019年
- 为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。
- 陈平刘冉黄萌萌朱金鲁谢芳倪宏波刘思国张跃灵
- 关键词：猪链球菌2型基因缺失同工酶
- 2型猪链球菌SsU05-0474的表达纯化及单克隆抗体制备被引量：2
- 2016年
- 为了鉴定2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,Ss2)菌毛骨架蛋白Ss U05-0474(本文中简称SsMps)在菌体中的位置和存在形式,本研究以2型猪链球菌05ZYH33菌株基因组作为模板,PCR扩增菌毛骨架蛋白基因Ss U05-0474,将其克隆至表达载体pET22b,构建重组质粒pET22b/SsMps,转化至E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达SsMps蛋白,并通过亲和层析纯化。纯化的SsMps蛋白免疫BALB/c雌鼠,利用细胞融合筛选制备该重组蛋白的单克隆抗体。结果显示,SsMps蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,分子质量大小为45 k Da。每升大肠杆菌培养物可获得SsMps重组蛋白约30 mg,纯度大于95%。获得了1株该重组蛋白的单克隆抗体1D9,抗体亚型为IgG1/κ。通过单抗1D9与05ZYH33菌体蛋白组分Western blot,发现该抗体能够特异识别SsMps,并定位出SsMps大部分存在于细胞壁蛋白成分中,呈不同聚体存在。本研究制备的SsMps纯化蛋白及其单克隆抗体为研究SsMps蛋白的功能提供了工具。
- 杨宝玲陈福广谢芳刘思国沈国顺张跃灵
- 关键词：2型猪链球菌蛋白纯化单克隆抗体
- 抗菌肽LL-37体外抗猪链球菌活性的研究
- 2022年
- 为探究抗菌肽LL-37对猪链球菌(SS)的体外抑菌作用,本研究通过化学合成法制备抗菌肽LL-37,测定其对猪链球菌2型(SS2)的最低抑菌浓度(MIC),结果显示LL-37对4株SS2临床分离株的MIC值为4μmol/L~8μmol/L,抑菌效果良好;绘制SS2在1μmol/L LL-37条件下的生长曲线,结果显示1μmol/L LL-37即可对SS2的增殖有抑制作用;通过杀菌试验分析LL-37对SS2的杀菌活性,结果显示4μmol/L LL-37能完全杀灭SS2;借助激光共聚焦显微镜(CLSM)评价LL-37对SS2的杀伤作用,结果显示LL-37能够破坏和杀伤SS2的膜结构;使用透射电镜观察LL-37作用后SS2细胞形态的变化情况,结果显示LL-37能使SS2膜结构破坏、内容物流出;采用96孔板微量法检测LL-37对SS2生物被膜(BF)形成的抑制作用,结果显示LL-37能抑制SS2 BF的生成,抑制效果随剂量增加而增强。本研究明确了抗菌肽LL-37对SS2具有抑菌和杀菌作用,进一步利用激光共聚焦显微镜和透射电镜证实了抗菌肽LL-37通过作用于BF对SS2发挥抑菌和杀菌作用的方式,为抗链球菌感染和促进LL-37的临床应用提供了实验依据。
- 金明洁张会会梁思宇张跃灵谢芳刘思国
- 关键词：LL-37猪链球菌抗菌
- 猪链球菌2型05ZYH33糖苷水解酶SSU05_1921和SSU05_1922的表达纯化及功能研究被引量：1
- 2022年
- 为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株高甘露糖型N-聚糖水解酶的结构域及功能,本研究通过BLAST检索,发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型N-聚糖水解酶SpGH92和EndoD同源的蛋白,分别为SSU05_1921(后简写为1921)和SSU05_1922(后简写为1922)。本研究通过原核表达系统和Ni-NTA柱亲和层析纯化,获得了1921和1922全长蛋白,以及1922蛋白的糖苷水解酶结构域1922-Cat。通过6个蛋白反应(不加蛋白的阴性对照、分别仅加1921和1922的蛋白反应2、3,同时加入1921和1922的蛋白反应4、5及同时加入1921和1922-Cat的蛋白反应6)的RNase B去糖基化试验,反应结束后分别通过SDS-PAGE及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析RNase B的水解(即去糖基化)产物,研究1921和1922水解高甘露糖型N-聚糖的功能。结果显示,1921为外切α-1,2-甘露糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖末端的α-1,2-甘露糖苷键;1922为内切β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖中的几丁二糖,作用位点为β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷键。且只有在1921去除所有的α-1,2-甘露糖苷键,1922才能彻底水解高甘露糖型N-聚糖。二者的联合作用(反应4)结果显示,在15 ku处出现单一条带,表明二者联合作用于RNase B的高甘露糖型N-聚糖后,将其彻底去糖基化为R-GlcNAc,且1921与1922-Cat的联合作用与上述联合作用结果一致,表明1922的主要催化结构域即为1922-Cat。因此选择1921与1922-Cat联合作用于RNase B的去糖基化反应研究不同pH、不同金属离子及EDTA和EGTA螯合物对该联合作用的影响。结果显示,该联合作用的最适pH为7.0~8.0,二价金属离子Cu^(2+)、Fe^(2+)、Ni^(2+)、Co^(2+)、Zn^(2+)均明显抑制1921与1922-Cat的联合作用,Ca;部分抑制该联合作用,而二价离子Mg;、Mn;和一价离子K^(+)、Na^(+)及二价金属离子螯合物EDTA和EGTA对该联合作用无明显抑制作用,表明1921和192
- 卫东高广娟武柳君朱金鲁刘思国刘冉张跃灵
- 关键词：糖苷水解酶
- 猪链球菌2型SSU05-1311蛋白的表达纯化和多克隆抗体的制备
- 2016年
- 以猪链球菌2型菌株05ZYH 33的基因组作为模板,PCR扩增SSU 05-1311(简称ssFbp)基因,克隆到表达载体pET22b中,构建重组质粒pET22b-ssFbp。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达SsFbp蛋白,并通过亲和层析纯化。纯化的SsFbp蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体。结果显示,Ss Fbp蛋白以可溶形式表达,分子质量大小为112ku。每升培养物获得SsFbp重组蛋白20 mg,纯度大于95%。免疫筛选后获得了ss Fbp蛋白的多克隆抗体。Western-blot结果显示,多克隆抗体能特异识别05ZYH33细胞壁蛋白组分中的SsFbp蛋白。本研究为进一步研究SsFbp蛋白的功能及其在致病性中的作用奠定了基础。
- 杨宝玲陈福广谢芳刘思国沈国顺张跃灵
- 关键词：猪链球菌2型多克隆抗体
- 猪链球菌LPxTG蛋白HP0197与外源蛋白的融合表达及融合蛋白抗原活性的检测被引量：1
- 2022年
- 为了从蛋白水平探究猪链球菌(S. suis)的表面LPxTG(Leu-Pro-x-Thr-Gly,x表示任何氨基酸)蛋白HP0197在S. suis表面展示外源抗原的可行性,本研究分别经PCR扩增HP0197蛋白的功能区编码基因片段hp0197(去除了HP1097全长蛋白aa1~aa40的转运信号肽序列和aa524~aa56的CWA基序)、hp0197-18 ku基因片段(即HP0197蛋白的18 ku结构域的编码基因)、hp0197-Loop基因片段(HP0197蛋白aa201~aa523的编码基因片段),并通过融合PCR将gfp基因融合至上述两段基因即HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区编码基因之间,并构建表达HP-GFP融合蛋白的重组质粒及表达HP0197蛋白的重组质粒,经测序鉴定后将其分别转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导后采用SDS-PAGE鉴定。采用Ni-NTA亲和树脂方法纯化HP0197蛋白和HP-GFP融合蛋白后分别免疫小鼠,经间接ELISA检测首免后不同时间各组小鼠血清中的HP0197抗体和GFP抗体水平,评价HPGFP融合蛋白和HP0197蛋白的抗原活性。SDS-PAGE结果显示,分别经原核系统表达并纯化了HP-GFP融合蛋白和HP0197蛋白。间接ELISA结果显示,单独免疫HP0197蛋白的小鼠产生了HP0197抗体,但未产生GFP抗体;而免疫HP-GFP融合蛋白的小鼠,既产生了HP0197抗体,也产生了GFP抗体,且在首免后28 d这两种抗体效价均达1:204 800。上述结果表明在HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区之间插入外源蛋白,可在保留HP0197蛋白自身抗原活性的前提下,有效发挥外源蛋白的抗原活性。本研究首次在蛋白水平上证实了S. suis的LPxTG蛋白HP0197作为载体蛋白用于在S. suis表面展示外源蛋白的可行性,为进一步构建S. suis表面蛋白展示系统奠定了基础。
- 朱金鲁卫东高广娟陈平刘思国张跃灵
- 关键词：猪链球菌载体蛋白
- 猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定被引量：3
- 2019年
- 为了筛选和鉴定用于猪链球菌(S.suis)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自S.suis2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在E.coli和S.suis中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在S.suis中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在S.suis中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是S.suis的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在S.suis遗传操作中具有很好的应用前景。
- 刘冉黄萌萌陈平朱金鲁谢芳刘思国张跃灵
- 关键词：猪链球菌强启动子烯醇化酶
- 利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株被引量：1
- 2022年
- 为在猪链球菌(S.suis)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据S.suis密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增S.suis中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS)。以相应模板及引物分别经PCR扩增S.suis mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2。采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化S.suis 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株。PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b。将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株)。通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%。通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选。随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率。各取6个单菌落经PCR及测序鉴定。结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%。PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFPpbp1b。本研究首次构建了高效的正/反向筛选标�
- 卫东陈平高广娟朱金鲁武柳君刘思国张跃灵
- 关键词：猪链球菌
