邢昕
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
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- Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立
- 2008年
- 目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。
- 朱恒锐汪云飞张庆慧武标邢昕刘晓颖范礼斌
- 关键词：基因表达转染蛋白质类细胞株
- 人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达
- 2010年
- 目的构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达。方法以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测。结果经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达。结论实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础。
- 邢昕刘晓颖武标汪云飞朱恒锐范礼斌
- 关键词：转染哺乳动物
- Sedlin突变体S124A对其与PAM14相互作用的影响
- 2009年
- 目的构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点。方法用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S124)设计定点突变引物;以pAS-Sedlin为模板,以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用DpnⅠ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序;将构建的定点突变质粒pAS-SedlinS与pACT2-PAM14共转化至酵母Y190中,并对生长至合适大小的克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。结果构建了pAS-Sedlin的定点突变质粒pAS-SedlinS,其与pACT2-PAM14共转克隆的β-半乳糖苷酶活性反应呈阳性,并且Sedlin S124A蛋白与PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白与PAM14蛋白相互作用强。结论成功构建了Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124并不是其与PAM14在酵母中相互作用的特异性结合位点。
- 汪云飞朱恒锐张庆慧邢昕武标刘晓颖范礼斌
- 关键词：双杂交系统技术骨骺
- 人Prohibitin 2哺乳动物细胞株的转染表达与定位的初步研究被引量：4
- 2010年
- 目的构建带FLAG标签的人类野生phb2(prohib-itin2)表达载体,将其转染至HEK293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察phb2蛋白在细胞内的定位。方法以含有人phb2全长cDNA序列的质粒为模板,通过带有FLAG标签上游引物,用PCR方法扩增phb2全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3中构建pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,将构建的质粒转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,转染表明此表达载体在HEK293T细胞中能够有效表达,在COS7细胞中phb2呈斑点状主要在胞质内分布,细胞核中未见到明显的表达。结论实验结果为进一步了解phb2的功能提供了一定的基础。
- 武标刘晓颖范礼斌邢昕朱恒锐汪云飞
- 关键词：基因表达转染
