马良
- 作品数：6 被引量：13H指数：2
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- 1株抗生素耐药微小脲原体hebnu3h07的全基因组测序及序列分析被引量：2
- 2018年
- 目的对1株从患者标本分离出的具有耐药性的微小脲原体hebnu3h07进行全基因组测序和生物信息学分析,为深入研究微小脲原体的基因组学特征及耐药机制提供依据。方法对从临床分离的微小脲原体hebnu3h07株进行培养鉴定并进行药敏试验,采用Ion torrent高通量测序技术对其进行全基因组测序,再使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、共线性分析、直系同源簇(COG)聚类分析、菌株分型和介导耐药的相关基因检测分析。结果微小脲原体hebnu3h07株对数种抗生素表现出不同程度的耐药性,其完整基因组大小为723 292bp,GC含量为25.4%,与现存3株微小脲原体完整序列比对发现其基因组序列较为保守,多位点序列分型属于ST1型,对介导耐药的基因检测发现数个突变位点。结论通过对此株抗生素耐药的微小脲原体的全基因组测序和导致耐药的基因位点分析,丰富了我国微小脲原体基因组数据,为微小脲原体的耐药机制研究提供了依据。
- 马良赫聪慧李萍贾晓晖贾天军
- 关键词：解脲脲原体全基因组耐药性
- ACBD3基因片段真核表达载体的构建与表达被引量：1
- 2017年
- 目的构建ACBD3基因片段真核表达载体并表达蛋白,为研究其与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147相互作用的分子机制奠定基础。方法根据与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147作用的配体核苷酸序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,通过PCR获得ACBD3基因片段,与pcDNA3.1+/Flag质粒经双酶切后在T4连接酶作用下连接,构建表达载体pcDNA3.1+/Flag-ACBD3,经菌落PCR、双酶切及质粒测序鉴定后转染HeLa细胞,采用Western blot与间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 PCR扩增目的基因片段约883bp,与预期相符。经菌落PCR、双酶切验证及测序分析重组质粒构建成功。间接免疫荧光法检测重组质粒转染后的HeLa细胞,观察到表达的蛋白位于细胞胞浆;SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位(Mr)为33.5×10~3,与预期相符。结论成功构建了pcDNA3.1+/Flag-ACBD3真核表达载体并实现目的蛋白的表达,为进一步研究其生物学功能及其与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147之间的相互作用奠定了基础。
- 马良程永婷赫聪慧贾晓晖李萍贾天军
- 关键词：真核表达载体WESTERNBLOT间接免疫荧光
- 肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法被引量：5
- 2016年
- 目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。
- 程永婷贾晓晖马良贾天军
- 关键词：肺炎衣原体TAQMAN探针实时荧光定量PCR
- 沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT813真核表达载体的构建及表达被引量：3
- 2016年
- 目的构建沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT813真核表达载体并观察其在Hela细胞中的表达,为研究其与宿主间的相互作用奠定基础。方法克隆CT813基因,分别对CT813与pcDNA3.1/Myc-HisA空质粒进行双酶切,T4连接酶进行连接,然后进行菌落PCR、酶切及测序鉴定;将构建的重组质粒pcDNA3.1/Myc-HisA-CT813转染Hela细胞后采用Western blot与间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 PCR显示,扩增的目的基因片段约795bp,与预期相符;经NotⅠ与kpnⅠ双酶切鉴定重组质粒构建正确,测定其序列与NCBI数据库完全一致;Western blot显示重组质粒转化Hela表达的CT813融合蛋白分子质量单位为29.4kd左右;间接免疫荧光法检测该蛋白位于细胞胞浆中,是衣原体分泌性蛋白。结论成功构建了PcDNA3.1/Myc-His A-CT813真核表达载体并表达了沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT813,对研究其生物学功能及与宿主配体间的相互作用具有重要意义。
- 程永婷贾天军李萍贾晓晖马良
- 关键词：WESTERNBLOT间接免疫荧光法
- 肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308与ACBD3相互作用的鉴定研究
- 肺炎衣原体（Chlamydia pneumonia，Cpn）是一种重要的非典型病原体，常可引起肺炎、支气管炎等呼吸系统疾病，也有研究表明其与心内膜炎、反应性关节炎等肺外疾病密切相关。肺炎衣原体感染宿主细胞后，主要依靠包涵...
- 马良
- 关键词：肺炎衣原体生物学功能
- 解脲脲原体UP3_c0006基因原核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2017年
- 目的构建解脲脲原体UP3_c0006基因原核表达载体并表达蛋白。方法根据NCBI上公布的解脲脲原体UP3_c0006基因序列设计上、下游引物,以解脲脲原体基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因,采用经酚氯仿法回收、纯化。BamHI和NotI酶分别对目的基因和原核表达载体pGEX-6P-2进行双酶切,酶切片段在T4连接酶作用下连接,连接产物经热休克法转化感受态大肠埃希菌XL1-Blue。转化菌接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养,进行菌落PCR筛选及测序验证。重组质粒转化菌用IPTG诱导3h,超声裂解菌体经GST Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白GST-UP3_c0006并进行SDS-PAGE鉴定。结果 PCR扩增UP3_c0006基因片段长327bp,构建的UP3_c0006原核表达载体转化XL1-Blue后进行菌落PCR鉴定,目的片段约为477bp,与预期相符。对重组菌扩大培养并提取质粒进行基因测序,结果与NCBI中UP3_c0006基因序列完全一致;诱导表达的重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE鉴定,融合蛋白GST-UP3_c0006分子质量单位约为38×103,与预期相符。结论成功构建了pGEX-6P-2-UP3_c0006原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得融合蛋白的表达,该蛋白主要存在于重组菌超声裂解上清中。
- 马良宋佳欣贾泽玮孙浩月李雪婷贾天军
- 关键词：解脲脲原体原核表达
