吴盟
- 作品数：2 被引量：13H指数：2
- 供职机构：中山大学附属第三医院更多>>
- 发文基金：教育部留学回国人员科研启动基金广东省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立被引量：5
- 2007年
- 目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与人乙型肝炎病毒(HBV)X基因的重组表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)与GFP融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBV X基因片段,PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点,转化宿主菌DH5#,采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx;采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBV X基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBV X重组表达载体pGFP-HBx;将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2,经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次,细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2/GFP-HBx细胞有HBV X转录、表达。结论成功构建了GFP-HBV X真核重组表达载体pGFP-HBx;获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系,这为进一步研究HBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。
- 杨林范红梅陈幼明谢奇峰吴盟陈雪娟李刚高志良
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白绿色荧光蛋白重组体细胞系
- 乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡被引量：8
- 2008年
- 目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。
- 范红梅杨林谢奇峰韩晓燕吴盟张富程姚春斓李刚高志良
- 关键词：细胞凋亡HBX蛋白阿霉素绿色荧光蛋白
