王林玉
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 供职机构：西安交通大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省社会发展科技攻关项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化
- 2017年
- 目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。
- 王博周艳侯卫坤蔡永松张英王林玉韩燕孟列素
- 关键词：原核表达系统融合蛋白细胞骨架
- STAT3荧光素酶报告基因检测系统的构建及其检测STAT3活化能力的研究被引量：3
- 2017年
- 目的构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统并检测STAT3活化能力,为筛选STAT3活性调控相关药物提供实验基础。方法基因合成STAT3反应元件序列,退火形成含酶切位点的双链DNA,内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切报告基因载体p GL6-TA,T4 DNA连接酶将STAT3反应元件插入p GL6-TA载体多克隆位点,将该载体转染He La细胞,G418筛选STAT3荧光素酶报告基因稳定表达的单克隆He La细胞株。5,10,20 ng/ml不同浓度激动剂IL-6和20,40,80μmol/L抑制剂S3I-201刺激单克隆He La-STAT3-Luc细胞,检测荧光素酶对应的发光值验证STAT3荧光素酶报告基因检测系统的检测能力。结果测序和比对结果显示,STAT3荧光素酶报告基因系统p GL6-STAT3-Luc中STAT3反应元件序列正确;G418成功筛选出稳定表达STAT3荧光素酶报告基因的单克隆He La细胞株;5,10和20 ng/ml浓度IL-6可刺激He La-STAT3-Luc细胞中荧光素酶的活性显著升高(P<0.001),且分别升高5.4,10.3和20.0倍;不同时间点检测1 ng/ml和5 ng/ml浓度IL-6刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性呈现线性增长趋势;40μmol/L和80μmol/L浓度的抑制剂S3I-201与10 ng/ml浓度IL-6共刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性显著降低(P<0.001),STAT3活化的抑制率分别为18.9%和43.7%。结论成功构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统,该系统具有有效检测STAT3活化水平的能力。
- 王博张英张英王林玉蔡永松周艳李琰清周艳
- 关键词：荧光素酶报告基因STAT3
- 人细胞角蛋白1基因的克隆、原核表达及纯化
- 2017年
- 目的克隆人细胞角蛋白1(cytokeratin 1,CK1),原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,用特异性引物PCR扩增人CK1编码区全长基因(NM_006121.3),内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR产物和p ET-28a载体,T4 DNA连接酶将人CK1编码区全长基因克隆到pET-28a载体上,IPTG诱导融合蛋白his-CK1的表达。融合蛋白经Ni^(2+)亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定表明构建表达载体中人CK1序列正确;融合蛋白his-CK1的相对分子量为70 kD,并在大肠杆菌中高效表达;融合蛋白以包涵体形式,在变性条件下纯化融合蛋白his-CK1,其纯度大于90%;纯化的融合蛋白his-CK1可与商品化CK1抗体以及His抗体特异性结合。结论成功构建了原核表达质粒pET-28a-CK1,并成功诱导表达及纯化融合蛋白his-CK1。
- 王博侯卫坤周艳蔡永松王林玉张英韩燕孟列素
- 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达系统
