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猪ISG15基因的克隆表达与多克隆抗体的制备: 2017年; 本研究从家猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出家猪ISG 15基因,经测序和序列分析,将ISG 15片段与p ET28a质粒连接,构建重组原核表达载体p ET28a-ISG15;经IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,以获得ISG15蛋白。用纯化的ISG15蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果显示,家猪ISG 15基因CD S区长504 bp,编码167个氨基酸,包括两个泛素样结构域(N端第3~75位和C端第81~156位氨基酸肽段)及C末端保守序列为LRLRGG;W estern-blot分析表明重组ISG15蛋白的免疫原性良好;经ELISA测定血清中抗体的效价为1∶102 400。上述研究结果为进一步揭示家猪ISG15蛋白的功能奠定了基础。; 李双双李新果石昂时庆贺杨利王玉国陈陆李永涛王川庆; 关键词：蛋白表达多克隆抗体

PRV感染PK-15细胞对prv-miR-LLT11a表达时相的影响: 2017年; 为研究伪狂犬病病毒(PRV)的致病机制,将PRV QBA株按0.5个感染复数(MOI)的剂量接种PK-15细胞,分别在感染后0、1、2、4、6、8、12、24 h收取细胞并提取microRNA(miRNA),采用茎环引物实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测prv-miR-LLT11a的表达时相。RT-q PCR扩增结果显示,熔解曲线峰值单一,扩增曲线拐点清晰。RT-q PCR检测结果表明,PRV QBA株感染PK-15细胞1 h后,prv-miR-LLT11a表达量极显著升高,随后表达量下调,在感染6 h后表达量降至最低,感染8 h后表达量持续急剧升高。; 杨利石昂李新果李双双时庆贺郑关民王玉国陈陆王川庆; 关键词：伪狂犬病病毒 PCR

潜伏感染期猪伪狂犬病病毒基因组甲基化预测及图谱测定: 2015年; 为研究DNA甲基化在PRV潜伏感染中的作用,本研究首先对PRV全基因组甲基化状态进行预测,再采用亚硫酸氢盐PCR测序的方法检测急性期及潜伏感染期IE180及EP0启动子区及转录起始位点附近区域的甲基化状态。结果显示,急性期及潜伏感染期IE180及EP0启动子区及转录起始位点附近区域均存在散在的甲基化位点,并未发现广泛的甲基化区域,与预测结果一致。结果表明,潜伏感染期间PRV基因组发生甲基化的可能性很小,进而可知DNA甲基化在PRV潜伏感染过程中未起到关键的作用。; 郑关民陈文定余秋颖陈陆张玉娟杨利李双双常洪涛李永涛赵军王川庆; 关键词：猪伪狂犬病病毒甲基化

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建: 2017年; 为获得表达猪白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。; 石昂时庆贺李新果王玉国杨利李双双陈陆王川庆; 关键词：IL-18基因真核表达载体克隆

河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析被引量：7: 2017年; 为监测和探究河南省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行株变异情况,本试验对15株2014-2015年间河南省PEDV流行株S基因进行克隆及全序列测定,与河南省2011-2013年流行株以及国内、外代表毒株进行同源性及遗传变异分析,并对这些毒株S基因的N-糖基化位点及跨膜螺旋区域进行预测。结果表明:本试验得到的15株毒株之间S基因核苷酸同源性为97.0%~99.8%,氨基酸同源性为97.0%~99.5%;与2011-2013年河南流行株核苷酸同源性为97.1%~99.0%,氨基酸同源性为97.2%~98.8%,与其他地区流行毒株核苷酸同源性为92.2%~99.0%,氨基酸同源性为91.9%~99.0%;与经典毒株相比,S1区域N端存在15bp的插入和6bp的缺失,核苷酸同源性为91.7%~93.6%,氨基酸同源性为92.0%~93.6%。系统发育建树结果显示目前的流行毒株与经典毒株处于不同的2个群,流行毒株分处不同亚群。对N-糖基化位点及跨膜螺旋区域的预测得知2014-2015年河南省PEDV与经典株相比出现变异,与2010年暴发时相比存在部分突变,毒株之间存在部分差异,研制出有效的针对流行毒的疫苗依然是目前防控该病的重中之重。; 韩莎莎张玉娟时庆贺石昂杨利常洪涛赵军王川庆陈陆; 关键词：猪流行性腹泻病毒基因变异

急性感染期猪伪狂犬病病毒部分基因组染色质状态被引量：2: 2017年; 为探究急性感染期猪伪狂犬病病毒(PRV)在宿主细胞内基因组染色质的状态,首先建立PRV实时荧光定量PCR(qPCR)方法并测定0.1 MOI PRV感染Neuro-2a细胞后病毒基因组的复制动态,然后收集PRV感染Neuro-2a细胞的样品进行染色质免疫共沉淀试验(CHIP),并通过qPCR测定病毒部分DNA与组蛋白H3结合形成的染色质状态。结果显示,PRV急性感染Neuro-2a细胞后,部分基因组以染色质结构存在,并与病毒复制有一定相关性。本研究成功建立用于研究PRV基因组染色质状态的CHIP试验方法,为PRV急性感染期表观遗传学研究提供依据。; 张玉娟韩莎莎时庆贺石昂杨利常洪涛赵军王川庆陈陆; 关键词：猪伪狂犬病病毒急性感染

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杨利