张巧霞
- 作品数：5 被引量：8H指数：1
- 供职机构：汕头大学医学院更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的功能性表达、纯化及活性鉴定被引量：5
- 2007年
- 目的:用原核蛋白表达系统对兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)进行功能性表达,并对其活性进行鉴定。方法:从兔肝中克隆出NRDR全长序列,运用Gateway表达系统将其编码区序列构建到表达载体(pDEST 17)上,再转化到大肠杆菌(E.coli)(BL21-AI)中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式;取工程菌裂解上清通过金属离子亲和层析纯化出目的蛋白,再运用反相高效液相色谱法(HPLC)测定该酶的Km值和Vmax值。结果:构建出含兔NRDR编码区(768 bp)的表达克隆,转化到BL21-AI中表达出氨基端含6×His标签的重组兔NRDR蛋白,诱导表达4 h后目的蛋白可占总蛋白量的41.4%;经一步亲和层析得到的兔NRDR纯度为97.2%,比活性提高了64倍;经HPLC测定,该酶对视黄醛的Km值为(4.55±0.33)μmol/L,Vmax为(0.307±0.065)μmol/(min.mg)。结论:应用pDEST 17可在BL21-AI中对兔肝NRDR进行高效的功能性表达。
- 谢健平刘戈飞宋旭红杜昆李蕊梁斌张巧霞黄东阳
- 关键词：纯化
- 兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素K3的还原作用和产物的鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的:检测兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素K3的催化活性并对该酶还原K3所生成的产物进行鉴定。方法:构建含6×His标签的兔NDRR的表达菌株,诱导表达并超声裂解后,通过Ni2+亲和层析纯化得到重组兔NDRR。在相对去氧隔绝空气反应体系以及存在高浓度十二烷基磺酸钠的反应条件下,利用高效液相色谱(HPLC)对兔NDRR还原K3的催化活性进行酶动力学研究。利用化学合成,HPLC及荧光光谱扫描对其还原产物进行鉴定。结果:诱导表达后的细菌裂解上清液经一步亲和层析后得到单一酶蛋白,其对K3的比活性分别是原空白菌裂解上清液和经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性的18.6和7.3倍。经过HPLC测定,兔NDRR对K3的Km值为30.7,Vmax0.046μmoL/(min.mg)。利用四氢硼酸钠与K3化学合成的产物进行HPLC分析,其保留时间与酶反应所产生的产物峰保留时间一致,而且反应后短时间内能利用荧光光谱扫描得到K4相应的光谱图。结论:兔NDRR对K3存在还原活性,并生成K4。
- 肖李锋刘戈飞宋旭红谢健平张巧霞李蕊黄东阳
- 关键词：维生素K3维生素K4高效液相色谱
- 抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶单克隆抗体的制备和鉴定
- 2008年
- 背景与目的:制备抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR]的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。材料与方法:以基因工程重组兔NRDR为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌兔NRDRmAb的细胞株。以间接ELISA法筛选阳性克隆、鉴定Ig亚类、细胞培养上清及腹水效价,同时采用Westernblot方法检测mAb的特异性。结果:获得3株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(NR1、NR2和NR5)。其抗体亚类均为IgG1,细胞培养上清效价依次为1∶20、1∶40和1∶20,腹水效价分别为1∶106、1∶107和1∶106。Westernblot结果显示NR1、NR2和NR5抗体均能有效识别兔肝组织中的NRDR及重组表达的兔NRDR。结论:成功地建立了稳定分泌兔NRDRmAb的杂交瘤细胞株,为NRDR生物学功能的进一步研究打下了基础。
- 杜牡丹宋旭红刘戈飞梁斌张巧霞李蕊谢健平甘雪琼黄东阳
- 关键词：单克隆抗体杂交瘤
- 正常肝和肝癌细胞中DHRS4L2基因选择性剪接亚型的克隆及其表达调控研究被引量：1
- 2010年
- 目的:鉴定正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞Hep-G2中DHRS4L2基因的选择性剪接新亚型,并探讨其表达调控机制。方法:应用RT-PCR,3′RACE和生物信息学方法发现并鉴定DHRS4L2基因的选择性剪接新亚型;去甲基化药物5-aza-dC处理HL-7702和Hep-G2细胞,通过RT-PCR和real-time PCR方法检测DHRS4L2的表达情况。结果:发现了2个新的DHRS4L2剪接亚型DHRS4L2A和DHRS4L2A3,2个新亚型均出现了新的第1个外显子,命名为Ea,前者缺失外显子1,后者缺失外显子1和3;在正常肝细胞中去甲基化后含DHRS4L2外显子1的转录产物比处理前明显增加,在肝癌细胞中则比处理前减少。结论:获得2个新的DHRS4L2剪接亚型,并发现DHRS4L2的表达和甲基化调控相关,且甲基化的调控作用在正常肝与肝癌细胞之间存在差异,其机制尚待进一步探讨。
- 甘雪琼宋旭红李蕊张巧霞杜牡丹黄东阳
- 关键词：选择性剪接
- 人神经母细胞瘤NRDR新剪接亚型A2的亚细胞定位被引量：1
- 2007年
- 背景与目的:研究hNRDRA2在真核细胞中的定位情况,并验证其羧基端预测的核定位信号(NLS)是否能引导蛋白核输入。材料与方法:分别构建hNRDRA2和NLS的绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,瞬时转染人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH、KP-N-NS及猴胚肾细胞COS-7,观察融合蛋白在3种细胞中的分布情况。结果:测序表明重组质粒构建正确,分别转染3种不同的细胞后,融合蛋白GFP-NLS表达阳性的细胞主要分布于细胞核中,GFP-A2表达阳性的细胞弥散分布于细胞质。结论:预测的NLS具有核定位功能,但携带该NLS的hNRDRA2外源表达的蛋白并不定位于细胞核。
- 李蕊宋旭红刘戈飞梁斌谢健平杜昆张巧霞黄东阳
- 关键词：核定位信号亚细胞定位绿色荧光蛋白
