蒋文超
- 作品数：2 被引量：9H指数：2
- 供职机构：西南大学更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金博士科研启动基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析被引量：2
- 2017年
- 精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列,分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构,其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30℃,最适pH为7.5。25℃时BmAK的催化活性最大,在15–30℃范围内,BmAK的结构相对稳定,活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础,有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。
- 何华伟王叶菁赵敏健位曙光赵朋蒋文超刘莉娜赵萍
- 关键词：家蚕精氨酸激酶表达纯化活性
- 家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析被引量：7
- 2017年
- 【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L^
- 何华伟王叶菁侯丽李瑜位曙光赵朋蒋文超赵萍
- 关键词：家蚕碱性磷酸酶表达纯化
