王斌
- 作品数：11 被引量：12H指数：2
- 供职机构：华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金广州市科技计划项目广东省科技计划工业攻关项目更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程农业科学更多>>
- RNA干扰技术降低黑曲霉细胞工厂的内源蛋白背景被引量：1
- 2014年
- 利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)改造黑曲霉细胞工厂,减少其内源蛋白表达背景。研究RNAi载体中反向互补片段特异性对RNA干扰的影响,同步干扰糖化酶基因glaA、淀粉酶基因amyA及蛋白酶调控因子基因prtT,并利用经RNA干扰改造的黑曲霉宿主SH-2表达异源脂肪酶基因tll。研究结果表明,不同长度的靶基因反向互补片段表现出不同程度的RNA干扰效应,载体pAMDS-RNAi-glaA388对糖化酶的干扰效果(94.40%)比载体pAMDS-RNAi-glaA784(70.60%)好;经三基因RNAi载体pAMDS-multi-RNAi改造的黑曲霉菌株中glaA、amyA、prtT的表达量仅为原始菌株的5.30%、17.10%和34.60%;利用经三基因RNAi载体改造的黑曲霉菌株表达脂肪酶tll,最高酶活达到97.27 U/mL,比利用原始菌株表达tll的最高酶活(73.05 U/mL)提高33.16%。因此,RNAi技术可以有效降低黑曲霉宿主内源蛋白的表达背景,有利于提高外源基因在黑曲霉细胞工厂中的表达水平和稳定性。
- 银超王云艳何攀陈婧王斌潘力
- 关键词：RNA干扰技术黑曲霉细胞工厂糖化酶淀粉酶
- 胰凝乳蛋白酶SplB在枯草芽孢杆菌中的重组表达及应用
- 2023年
- 通过启动子优化、宿主筛选,构建了C端带His-tag的胰凝乳蛋白酶类蛋白酶SplB表达载体,成功实现了SplB在枯草芽孢杆菌中的重组表达,对纯化的重组SplB进行酶学性质研究,并实现了重组蛋白酶SplB在重组蛋白Prx标签切割中的应用。结果表明,以枯草芽孢杆菌ATCC6051Δ10为宿主,通过启动子P_(43)介导的重组蛋白酶SplB表达活力最高(10.24 U/mL)。通过亲和层析纯化了重组表达的SplB,并进行酶学性质研究,其最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且具有良好的温度和pH值稳定性。在离子浓度较低情况下,Co^(2+)对重组SplB活力有促进作用,Mg^(2+)、K^(+)不影响酶活力;而Cu^(2+)、Zn^(2+)、Ni^(+)离子抑制SplB活力;十二烷基硫酸钠极大抑制重组SplB活力。将重组SplB应用于切割重组蛋白Prx的标签,结果表明,重组SplB具有WELQ肽段标签切割作用,并且SplB浓度越高,目标条带越浓。本研究为优化SplB的重组表达及在食品、医药领域的应用提供支持。
- 潘丽洁王斌潘力
- 关键词：枯草芽孢杆菌
- 米曲霉谷氨酰胺酶在黑曲霉中的重组表达与酶学特性
- 2022年
- 该研究将米曲霉RIB40(Aspergillus oryzae RIB40)来源的谷氨酰胺酶(GahB)在黑曲霉(Aspergillus niger)宿主中分泌表达。基于该研究所建立表型鉴定板与孔板培养的通量鉴定筛选方法成功得到重组表达谷氨酰胺酶的转化子H-GahB,最高酶活力达到1.35 U/mL。为了增加目的基因在宿主中的拷贝数,采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术重新构建高拷贝的谷氨酰胺酶表达菌株C-GahB,其酶活力提高到3.56 U/mL,约为H-GahB的2.64倍。进一步采用ARTP诱变技术对C-GahB进行传统诱变育种,获得了谷氨酰胺酶工程菌株A-GahB,其酶活力提升到4.16 U/mL,比出发菌株C-GahB的酶活力提高了0.17倍。纯化后的重组GahB的比酶活达到40.63 U/mg,最适温度为37℃,最适pH值为7.0,其在20~40℃及pH值5.5~8.0之间稳定性较好。K+对GahB的酶活力具有激活作用,Zn^(2+)和Mn^(2+)则对GahB的酶活力有较为强烈的抑制作用。当盐质量分数为18%时,GahB表现出35.38%的相对酶活力。该研究第一次在黑曲霉中实现了来源于米曲霉RIB40的谷氨酰胺酶GahB的重组分泌表达,为此后对米曲霉谷氨酰胺酶的研究提供了基础。
- 陈颖王斌潘力
- 关键词：谷氨酰胺酶曲霉
- 黑曲霉丝氨酸羧肽酶的重组表达及其水解大豆蛋白的效果分析被引量：1
- 2022年
- 丝氨酸羧肽酶能够剪切肽链C末端的氨基酸,在大豆蛋白脱苦中有着广泛的应用。该研究将黑曲霉中3个丝氨酸羧肽酶基因(CPG、CPF、CPA)在低背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达。利用启动子PnaⅡ、终止子Ttef和营养缺陷型筛选标记pyr G构建分别含自身信号肽和糖化酶信号肽的丝氨酸羧肽酶表达载体;利用PEG介导的转化法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,构建了丝氨酸羧肽酶重组表达菌株。通过摇瓶发酵筛选得到高表达重组菌株HL-CPG,其丝氨酸羧肽酶酶活达到163.71 U/mL。利用6ⅹHis标签进行镍柱亲和层析得到单一的丝氨酸羧肽酶CPG并研究了其酶学性质,该酶最适反应温度为40℃,最适p H为3.5,Cu^(2+)具有明显抑制效果。另外,将重组表达的丝氨酸羧肽酶CPG与胃蛋白酶复配水解大豆蛋白,水解液中疏水性氨基酸Leu、Tyr和Phe的含量分别增加606.47μg/m L、434.06μg/m L和205.11μg/m L。综上所述,该研究在黑曲霉中成功实现丝氨酸羧肽酶的高效表达,对大豆蛋白水解液脱苦处理工艺具有一定的借鉴意义。
- 喻豆潘力王斌
- 关键词：黑曲霉
- 人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析
- 2023年
- 胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。
- 蔡思泽王斌
- 关键词：胶原蛋白毕赤酵母抗氧化
- 溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析
- 2023年
- 该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力(869.74 U/mL)的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力(358.41 U/mL)的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。
- 顾力行王斌潘力
- 关键词：溶菌酶黑曲霉酶学性质
- 南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用被引量：5
- 2019年
- 为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)表达量,根据黑曲霉(Aspergillus niger)密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50℃和8.0,在pH 6.0~9.0和45℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2+、Zn2+和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2+、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。
- 张玲敏王斌潘力
- 关键词：黑曲霉分泌表达酶学性质固定化酯化
- 重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究被引量：2
- 2018年
- 猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。
- 王斌罗时渝谢景毅叶燕锐潘力
- 关键词：猪圆环病毒2型毕赤酵母
- 重组β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其在糖化反应中的应用
- 2021年
- β-淀粉酶(β-amylase,AmyM)是一种重要的工业用酶,广泛应用在啤酒酿造、制糖等行业中。本研究利用Bacillus megatherium DSM 319来源的β-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6051Δ10)中分泌表达。首先,构建不同单启动子和双启动子介导β-淀粉酶表达的重组菌株,在摇瓶培养条件下,由P43-P43介导的双启动子重组菌株在发酵培养27 h时,分泌β-淀粉酶酶活力最高达2950.76 U/mL;随后研究碳代谢阻遏效应(Carbon Catabolite Repression,CCR)对重组β-淀粉酶表达的影响,发现对分解代谢控制蛋白(Catabolite control protein A,CcpA)在DNA上顺式调控元件的碱基位点进行定点突变,可以有效缓解碳阻遏效应,β-淀粉酶酶活提高到4663.03 U/mL;最后,将重组β-淀粉酶应用在糖化反应过程中,结果表明麦芽糖转化率可以达到57.62%。综上,本研究成功构建出β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达体系,为工业化生产β-淀粉酶提供了理论数据支撑。
- 曾君瑞潘力王斌
- 关键词：Β-淀粉酶枯草芽孢杆菌启动子
- 体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M被引量：1
- 2021年
- 为建立体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M(Rebaudioside M,RM),该文分别构建了含有甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1和水稻来源的糖基转移酶EUGT11以及拟南芥来源的蔗糖合成酶SUS1的重组大肠杆菌,将甜菊苷经一锅法催化合成RM。为提升该体系中限速酶EUGT11的酶活,从而提升整个体外多酶级联反应体系的RM产量,本文将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联,并比较一重、二重、三重和四重启动子启动转录时该酶活性,当三重启动子启动转录时,重组酶EUGT11的酶活力最高,是一重启动子启动转录时的2.13倍,在酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39的体外多酶级联反应体系中,RM产量为3.79 mmol/L,较酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3的体外多酶级联反应体系中,RM的产量提升了2.35倍。该文成功建立了高效合成RM的体外多酶级联反应体系,为此后工业化酶法合成RM提供理论和数据支持。
- 刘思颖王斌潘力
- 关键词：甜菊糖苷
