刘敏
- 作品数：6 被引量：1H指数：1
- 供职机构：扬州大学兽医学院更多>>
- 发文基金：江苏高校优势学科建设工程项目国家自然科学基金江苏高校优势学科建设工程资助项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 鸡黑素皮质素受体3真核表达载体及突变型的构建和表达
- 2018年
- 试验旨在构建鸡黑素皮质素受体3(c MC3R)基因的真核表达载体,并在人源胚胎肾细胞(HEK293T)观察目的基因的表达情况。从新鲜鸡血液提取全基因组DNA,并以其为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。凝胶纯化回收目的基因,用限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ目的基因和真核表达载体pc DNA3.1(+),并将双酶切后的目的基因定向插入表达载体中。经酶切和测序正确后加入c-myc标签。单点突变构建pc DNA3.1(+)-myc/MC3R突变型,用脂质体法将重组质粒pc DNA3.1(+)-myc/MC3R分别瞬时转染入HEK293T细胞中,流式细胞仪检测野生型和突变型的细胞表面表达和胞内总表达。结果表明,成功构建了鸡MC3R基因野生型和四个突变型(M54L、G104S、L151R和S183S)的真核表达载体,突变型与野生型在HEK293T细胞中的表面表达和胞内总表达没有显著性差异,研究结果为进一步研究c MC3R功能奠定基础。
- 谢华杰张海洁江礼捷连俊伟刘敏闵天奇王志强
- 关键词：真核表达细胞表面表达
- 猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达
- [目的]本研究旨在构建猪β2肾上腺素能受体(β2AR)基因及其突变体的真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达.[方法]本研究从猪基因组DNA克隆猪β2AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA...
- 谢华杰张海洁江礼捷连俊伟刘敏闵天奇王志强
- 关键词：真核表达载体突变体
- 鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体及突变型的构建及信号通路初探被引量：1
- 2019年
- 试验旨在构建鸡、鸭、鹅黑素皮质素受体5(Melanocortin Receptor-5,MC5R)及其突变体的真核表达载体,并比较野生型与突变体MC5R在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达及功能的差异。从三种家禽血液中分别提取全基因组DNA,以其为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。用同源重组方法将扩增的目的基因片段定向插入表达载体pcDNA3.1(+)中。单点突变构建pcDNA3.1(+)-MC5Rs突变型。用脂质体法将三种禽类野生型和突变型重组质粒pcDNA3.1(+)-MC5Rs分别瞬时转染入HEK293T细胞中,用双萤光素酶报告基因法检测胞内第二信使cAMP水平的变化来反应受体的表达和激活情况。结果表明:成功构建了鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体与各3个突变型(D119A、F254A和H257A)。在HEK293T细胞中表达时,与野生型相比,F254A的基础活性大幅升高,D119A与H257A的基础活性变化不大;D119A与H257A对激动剂α-MSH的反应活性完全丧失,F254A对于激动剂α-MSH的反应活性降低,为进一步研究体外鸡、鸭、鹅MC5R功能奠定基础。
- 闵天奇贾琼韩蕊苏语兮嵇祝星王泽源刘敏崔子鹤张海洁肖霞肖霞
- 关键词：真核表达
- 猪食欲肽2受体突变体真核表达载体的构建及其对cAMP信号通路的影响
- 2018年
- 试验旨在构建猪食欲肽2受体(porcine orexin 2receptor,pOX2R)突变体的真核表达载体,探究其野生型与突变体的基础药理学活性差异。以pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型质粒为模板,设计特异性引物单点突变构建4种突变体:pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I和pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-T401I,将pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型和4种突变体分别瞬时转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测法测定pOX2R野生型及突变体的基础活性,并检测不同浓度激动剂作用下细胞内cAMP水平,随后用内源性激动剂食欲肽A(OXA)及食欲肽B(OXB)分别对野生型及突变体进行刺激。结果显示,4个突变体构建成功,pOX2R的第10、11、308和401位氨基酸分别突变为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。将pOX2R的野生型及4个突变体瞬时转染HEK293T细胞后,野生型与突变体的基础活性值无显著差异(P>0.05),表明这4个位点的氨基酸突变对其受体的基础表达信号无显著影响。与野生型受体相比,突变型受体对激动剂OXB的响应无显著差异(P>0.05),而突变体P10S、P11T和T401I对激动剂OXA的响应EC50显著降低(P<0.05),其Rmax无显著差异(P>0.05)。推测第10、11和401位点的氨基酸突变可能影响了激动剂OXA与受体的结合,降低了激动剂的激动效应。本研究结果为进一步体外研究pOX2R的功能奠定了基础。
- 刘敏闵天奇张海洁谢华杰崔子鹤王志强
- 关键词：突变体CAMP
- 大熊猫大麻素受体1、2真核表达载体的构建及表达
- [目的]构建大熊猫大麻素受体1(am CBR1)、大熊猫大麻素受体2(amCBR2)的真核表达载体，并使两者在真核细胞中表达.[方法]设计含有酶切位点XhoⅠ和Hind Ⅲ的引物，用大熊猫血液中提取的基因组DNA为模板，...
- 闵天奇昝亚楠刘敏蓝玮璇蒋永嘉肖珈瑜王志强
- 关键词：大麻素受体1大麻素受体2真核表达
- 猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达
- 2017年
- 试验旨在构建猪β_2肾上腺素能受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β_2AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β_2AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N、myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-C285S和mycpcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β_2AR基因已正确重组入pcDNA3.1(+)载体中;经测序鉴定,猪β_2AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β_2AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β_2AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。
- 张海洁谢华杰江礼捷连俊伟刘敏闵天奇王志强
- 关键词：真核表达载体突变体WESTERNBLOTTING
